Современные методы исследования свойств сырья и продуктов животного происхождения. Лабораторный практикум. Учебное пособие

Охратоксины - соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом. Охратоксины А, В, С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L-фенилаланином

пептидной связью. Основными проду-

центами являются микроскопические грибы

Aspergillus ochraceus и Penicillium viridicatum.

Физико-химические свойства. Охратоксин А – Охратоксин бесцветное кристаллическое вещество, слабо раствори-

мое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе гидрокарбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В ультрафиолетовом свете обладает зеленой флуоресценцией. Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В ультрафиолетом свете обладает голубой флуоресценцией. Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В ультрафиолетовом свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.

Биологическое действие. Охратоксины входят в группу микотоксинов, преимущественно поражающих почки. При остром токсикозе, вызванном охратоксинами, патологические изменения выявляются и в печени, и в лимфоидной ткани, и в желудочнокишечном тракте. Доказано, что охратоксин А обладает сильным тератогенным действием. Вопрос о канцерогенности охратоксинов для человека остается нерешенным.

61

Механизм действия охратоксинов. Биохимические, моле-

кулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. В исследованиях in vitro показано, что они активно связываются с различными белками: альбуминами сыворотки крови, тромбином, альдолазой, каталазой, аргиназой, карбоксипептидазой А. Некоторые моменты подтверждены и в исследованиях in vivo. Результаты изучения влияния охратоксинов на синтез макромолекул свидетельствуют, что охратоксин А ингибирует синтез белка и матричной РНК (токсин действует как конкурентный ингибитор), но не действует на синтез ДНК.

Загрязнение пищевых продуктов. Основными раститель-

ными субстратами, в которых обнаруживаются охратоксины, являются зерновые культуры и среди них, в первую очередь, кукуруза, пшеница, ячмень.

Трихотеценовые микотоксины. В настоящее время извест-

но более 40 трихотеценовыхмикотоксинов (ТТМТ), вторичных метаболитов различных представителей микроскопических грибов рода Fusarium, которые являются возбудителями так называемых гнилей корней, стеблей, листьев, семян, плодов, клубней и сеянцев сельскохозяйственных растений. По своей структуре эти вещества относятся к сесквитерпенам. Они содержат основное ядро из трех колец, названное трихотеканом. В зависимости от структуры трихотеценового ядра эти микотоксины подразделяются на 4 группы: А, В, С, Д.

Физико-химические свойства. ТТМТ – это бесцветные кри-

сталлические, химически стабильные соединения, плохо растворимые в воде. ТТМТ типа А растворимы в умеренно полярных растворителях (ацетон, хлороформ), типа В – в более полярных растворителях (этанол, метанол и др.). Эти токсины, за исключением некоторых, не обладают флюоресценцией. В связи с этим, для их обнаружения, после разделения методом тонкослойной хроматографии, используют различные способы (например, нагревание до 100-150 °С после обработки спиртовым раствором серной кислоты) с целью получения окрашенных или флуоресцирующих производных.

62

Биологическое действие ТТМТ. Алиментарные токсикозы,

вызванные употреблением в пищу пищевых продуктов и кормов, пораженных микроскопическими грибами, продуцирующими ТТМТ, можно отнести к наиболее распространенным микотоксикозам человека и сельскохозяйственных животных.

Механизм действия ТТМТ. Многочисленными исследованиями in vitro и in vivo показано, что ТТМТ являются ингибиторами синтеза белков и нуклеиновых кислот, вызывают нарушения стабильности лизосомных мембран и активацию ферментов лизосом, что в конечном счете приводит к гибели клетки.

Патулин и некоторые другое микотоксины.Микотоксины,

продуцируемые микроскопическими грибами рода Penicillium patulum и Penicillium expansu, распространены повсеместно и представляют реальную опасность для здоровья человека, поскольку характеризуется канцерогенными и мутагенными свойствами. Максимальное токсинообразование отмечается при тем-

пературе 21-30°С.

По своей химической структуре это вещество является 4-гидроксифуропираном. Оно имеет один максимум поглощения в ультрафиолетовой области при 276 нм.

Биологическое действие патулина проявляется как в виде острых токсикозов, так и в виде ярко выраженных канцерогенных и мутагенных

Патулин эффектов. Биохимические механизмы действия патулина изучены недостаточно. Предполагают, что патулин блокирует синтез ДНК, РНК и белков, причем бло-

кирование инициации транскрипции осуществляется за счет ингибирования ДНК-зависимой-РНК-полимеразы. Кроме этого, микотоксин активно взаимодействует с SH-группами белков и подавляет активность тиоловых ферментов.

Продуценты патулина поражают в основном фрукты и некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах, абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике, облепихе, айве, томатах. Наиболее

63

часто патулином поражаются яблоки, где содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг.

Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах переработки фруктов и овощей: соках, компотах, пюре и джемах. Особенно часто его находят в яблочном соке (0,02- 0,4 мг/ дм3). Содержание патулина в других видах соков: грушевом, айвовом, виноградном, сливовом, манго - колеблется от 0,005 до 4,5 мг/ дм3. Интересным представляется тот факт, что цитрусовые и некоторые овощные культуры такие, как картофель, лук, редис, редька, баклажаны, цветная капуста, тыква и хрен, обладают естественной устойчивостью к заражению гриба- ми-продуцентами патулина.

Среди микотоксинов, продуцируемых микроскопическими грибами рода Penicillium и представляющих серьезную опасность для здоровья человека, известны лютеоскирин, циклохлоротин, цитреовиридин и цитринин.

Лютеоскирин (продуцент Penicillium islandicum) - желтое кристаллическое вещество, выделен из длительно хранившегося риса, пшеницы, сои, арахиса, бобовых и некоторых видов перца. Механизм токсического действия связан с ингибированием ферментов дыхательной цепи (печени, почках, миокарде), а также в подавлении процессов окислительного фосфорилирования.

Циклохлоротин (продуцент Penicillium islandicum) - белое кристаллическое вещество, циклический пептид, содержащий хлор. Биохимические механизмы токсического действия направлены на нарушение углеводного и белкового обмена и связаны с ингибированием целого ряда ферментов. Токсическое действие циклохлоротина проявляется в нарушении регуляции проницаемости биологических мембран и процессов окислительного фосфорилирования.

Цитреовиридин (продуцент Penicillium citreo-viride) - жел-

тое кристаллическое вещество, выделен из пожелтевшего риса. Обладает нейро-токсическими свойствами.

Цитринин (продуцент Penicillium citrinum) - кристалличе-

ское вещество желтого цвета, выделен из пожелтевшего риса. Цитринин часто обнаруживается в различных зерновых культу-

64

рах: пшенице, ячмене, овсе, ржи, а также в кукурузе и арахисе. Незначительные количества цитринина найдены в хлебобулочных изделиях, мясных продуктах и фруктах. Обладает выраженными нефротоксическими свойствами.

Химические токсины.Подавляющее большинство пищевых продуктов в качестве примесей содержат ксенобиотики и химические токсиканты такие, как пестициды и продукты их разложения, антибиотики, фунгициды, гормоны и их метаболиты, тяжелые металлы, диоксины, в том числе радионуклиды (цезий137, стронций-90, йод-131).

Первичное загрязнение большинством веществ этой группы возникает как результат промышленных выбросов и неправильной организации сельскохозяйственного производства. Попадание в пищевые продукты происходит через почву и воду. Как в окружающей среде, так и в пищевых продуктах химические токсины сохраняются длительно, проходя по всем звеньям пищевой цепи.

Воздействие химических контаминантов, которые могут попасть в пищевые продукты в дозах, превышающих предельно допустимые, заключается как в общетоксическом действии, так и в появлении специфических и отдаленных эффектов (аллергенного, мутагенного, тератогенного или канцерогенного).

Важной группой токсических веществ являются диоксины и полихлорированные дифенилы (ПХД). Диоксины образуются при сгорании различных синтетических веществ. ПХД специально производились для нужд электротехники. Сейчас их производство резко сокращено, но они крайне устойчивы в окружающей среде и продолжают циркулировать как в воде, так и в пище. Эти вещества токсичны, угнетают иммунную и эндокринную системы, ряд других функций организма, а также обладают канцерогенным действием.

К наиболее активным канцерогенам относят 3,4- бенз(а)пирен, который был идентифицирован в 1933 г. как канцерогенный компонент сажи и смолы, а также холантрен, перилен и дибенз(а)пирен:

65

Бенз(а)пирен Холантрен

Перилен

Дибенз(а)пирен

К малотоксичным полициклическим ароматическим углеводородам относят антрацен, фенантрен, пирен, флуорантен:

Канцерогенная активность реальных сочетаний полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на 70-80% обусловлена бенз(а)пиреном. Поэтому по присутствию бенз(а)пирена в пищевых продуктах и других объектах можно судить об уровне их загрязнения и степени онкогенной опасности для человека.

Канцерогенные ПАУ образуются в природе путем абиогенных процессов; ежегодно в биосферу поступают тысячи тонн бенз(а)пирена природного происхождения. Еще больше - за счет

66

техногенных источников. Образуются ПАУ в процессах сгорания нефтепродуктов, угля, дерева, мусора, пищи, табака, причем, чем ниже температура, тем больше образуется ПАУ.

Впищевом сырье, полученном из экологически чистых растений, концентрация бенз(а)пирена 0,03-1,0 мкг/кг. Условия термической обработки значительно увеличивают его содержание до 50 мкг/кг и более. Полимерные упаковочные материалы могут играть немаловажную роль в загрязнении пищевых продуктов ПАУ, например, жир молока экстрагирует до 95 % бенз(а)пирена из парафинобумажных пакетов или стаканчиков.

Всельском хозяйстве широко используются пестициды, гербициды, удобрения, стимуляторы роста животных и т. д. Пестицидам изначально свойственна токсичность, и их нередко выявляют в различных пищевых продуктах. Поступая в организм с пищевыми продуктами, они подвергаются биотрансформации, и это затрудняет их обнаружение и осложняет раскрытие механизмов воздействия на человека. Кроме того, промежуточные продукты биотрансформации ксенобиотиков бывают более токсичны, чем первоначальный ксенобиотик, в связи с этим огромное значение приобретает опасность отдаленных последствий.

С целью повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, профилактики заболеваний, сохранения качества кормов в животноводстве широко применяются различные лекарственные и химические препараты. Это антибактериальные вещества (антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны), гормональные препараты, транквилизаторы, антиоксиданты и другие. Попадая в организм человека, они нарушают равновесие эндокринной системы, могут вызывать изменения в репродуктивной сфере. Нитраты, присутствующие в воде, почве, пище, также оказывают негативное действие на организм. Важно обеспечить необходимый контроль остаточных количеств этих загрязнителей в продуктах питания, используя для этого быстрые и надежные методы.

Токсические эффекты химических факторов разнообразны, что определяется тропностью к конкретным тканям организма и сродством к определенным ферментам. Так, свинец характеризу-

67

ется тропностью к нервной системе, особенно в раннем возрасте, нарушая правильное развитие и функции мозга. Кадмий повреждает, прежде всего, иммунную и репродуктивную системы, вызывает тератогенные эффекты. Многие ксенобиотики и токсиканты характеризуются канцерогенными свойствами, в том числе прямыми. В настоящее время определена роль отдельных токсических веществ в развитии некоторых форм рака, заболеваний сердечнососудистой и нервной систем, а также печени и почек.

В современной литературе обсуждается негативное действие химических токсинов в тех случаях, даже когда их количество в пищевых продуктах существенно ниже уровня установленных гигиенических нормативов. Доказано модифицирующее действие химических факторов малой интенсивности, обусловливающее неспецифическое влияние на здоровье человека. В его основе лежит системное нарушение гомеостаза организма, в результате которого наблюдается увеличение числа и ухудшение течения практически любых заболеваний, независимо от их этиологии.

Природные токсины.В данную группу включают вещества разнообразной химической структуры, присутствие которых в пищевом продукте обусловлено природными факторами.

Так, в картофеле присутствует гликозид соланин, который может вызывать отравление. В миндале и в ядрах абрикоса обнаруживается амигдалин, в ямсе – диоскорин. В ряде случаев эти вещества накапливаются в продуктах в значительных количествах при нарушении технологии хранения и/или переработки.

Часть природных пищевых токсинов фармакологически активна, а продукты, их содержащие, используются в медицине и лечебном питании. Включение картофеля в рацион больных язвенной болезнью и гастритом обусловлено в том числе и наличием соланина. Будучи гликозидом, родственным по структуре и свойствам сердечным гликозидам, соланин улучшает репаративные процессы в стенке желудка, нормализует моторную функцию желудочно-кишечного тракта, улучшает кровообращение и энергообеспечение. Препараты, получаемые из ямса, используются для регуляции гормонального статуса в связи с наличием в его

68

составе диоскорина – вещества, схожего по своему строению со стероидными гормонами.

Многие природные пищевые токсины не обладают лечебным потенциалом, следовательно, продукты, их содержащие, должны употребляться в ограниченном количестве. Например, в бобовых, особенно в соевых бобах, содержатся ингибиторы протеаз – вещества, накапливающиеся в семенах и предназначенные для их лучшего сохранения. Блокирование протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте приводит к недостаточному перевариванию белков бобовых продуктов, нарушению работы органов пищеварения, развитию дисбактериоза кишечника. Переработка высокоценных белков сои в питании человека возможна только после удаления из пищевого сырья ингибиторов протеаз.

В настоящее время наблюдаются отчетливые изменения человеческой популяции. Они выражаются в том, что растет число уязвимых категорий людей, а именно пожилых и старых, увеличивается число больных хроническими заболеваниями, иммунодефицитом различного происхождения. Следовательно, актуальными становятся контроль, мониторинг и создание системы профилактики контаминации пищи.

Обеспечение химической и биологической безопасности пищевых продуктов на общем фоне ухудшения показателей здоровья населения России (уменьшения продолжительности жизни, увеличения заболеваемости и случаев смерти, связанных с болезнями органов пищеварения, кровообращения, расстройством питания и нарушением обмена веществ) входит в число приоритетных задач по реализации государственной политики в области здорового питания населения. И рассматривается как важное направление обеспечения продовольственной безопасности.

Порядок выполнения работы

Метод основан на экстракции афлатоксинов В1 и М1 из пробы продукта, очистке экстракта от примесей и измерении массовой концентрации афлатоксинов В1 и М1 с помощью тон-

69

кослойной хроматографии при визуальном определении количества вещества в пятне.

Диапазон измеряемых содержаний афлатоксина В1 во всех продуктах, кроме молочных: 0,003-0,02 мг/кг; в молочных про-

дуктах: 0,0005-0,003 мг/кг; афлатоксина М1 – 0,0005-0,005 мг/кг.

Отбор проб и подготовку их к испытанию осуществляется по методам, указанным в нормативных документах на конкретную продукцию.

Приготовление основных растворов афлатоксинов В1 и В2. 1 мг кристаллического афлатоксина В1 количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3. В другую мерную колбу такой же вместимости количественно переносят 1 мг афлатоксина В2. В колбы вносят по 2 см3 ацетонитрила. Содержимое колб тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов афлатоксинов, после чего объем в колбах доводят до метки бензолом и содержимое колб вновь тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксинов в полученных основных растворах составляет около 10 мкг/см3. Основные растворы хранят в закрытых мерных колбах, плотно завернутых в алюминиевую фольгу, в холодильнике. Срок годности основных растворов афлатоксинов – год.

Точную концентрацию афлатоксинов В1, и В2 в основных растворах определяют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность слоя раствора толщиной 1 см по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны 362 нм. В качестве контрольного раствора используют смесь бензол-ацетонитрил (98:2).

Массовую концентрацию афлатоксинов В1 и В2 в основных растворах, мкг/см3, вычисляют по формуле

c= D × M ×1000 ,

ε×l

где D – оптическая плотность раствора;

70