Современные методы исследования свойств сырья и продуктов животного происхождения. Лабораторный практикум. Учебное пособие

держимому стаканов и выдерживают при комнатной температуре в течение 60 мин для формирования осадка.

Высушенные при температуре 60 °С до постоянной массы (разница между взвешиваниями не должна превышать 0,001 г) и взвешенные (с точностью до 0,0001 г) бумажные фильтры помещают в стеклянные воронки и смачивают этиловым спиртом 95 % об., осадок, содержащий пищевые волокна, фильтруют количественно, смывая со стенок стаканов порциями этилового спирта, затем осадок на фильтре промывают три раза порциями этилового спирта 78 % об. по 20 см3, два раза порциями этилового спирта 95% об. по 10 см3 и два раза порциями ацетона по 10 см3.

Осадки на фильтрах высушивают при температуре 105 °С в сушильном шкафу до постоянной массы (разница между взвешиваниями не должна превышать0,001 г). Фильтры охлаждают в эксикаторе и взвешивают с точностью до 0,0001 г.

В одном из двух осадков определяют содержание азота методом Кьельдаля по ГОСТ 26889. Полученное значение умножают на 6,25, получая содержание белка. Во втором осадке в зависимости от вида функционального пищевого продукта определяют содержание золы по ГОСТ 5901-87, ГОСТ 15113.8-77, ГОСТ

25555.4-91 или ГОСТ Р 51418-99.

Выполняют два независимых определения в двух различных пробах одного и того же образца.

Общую массовую долю пищевых волокон X, %, от массы обезжиренного сухого вещества вычисляют по формуле

где m1 – масса навески сухой обезжиренной пробы, г; m2 – масса осадка, г;

w1 – массовая доля белка в осадке, % (ГОСТ 26889), вычисляемая по формуле

51

Лабораторная работа № 5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПИЩЕВЫХ ТОКСИНОВ В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ

ПРОДУКТАХ (ГОСТ 30711 – 2001)

Цель работы: освоить сущность и методику определения содержания афлатоксинов В1 и М1 в молоке и молочных продуктах.

Приборы, материалы и реактивы: мерные колбы объе-

мом 100 см3; пипетки на 10 см3; растворы афлатоксинов В1 и В2; смешанный раствор хлористого натрия и лимонной кислоты; ацетонитрил; бензол; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр с λ = 362 нм.

Теоретические сведения

Обеспечение безопасности пищевых продуктов – одна из главных задач современного общества.

Известно, что питание является важнейшим фактором сохранения здоровья, профилактики ряда заболеваний, обеспечивает нормальный рост и развитие детей, подростков, поддерживает высокую работоспособность взрослого населения, улучшает качество и продолжительность жизни. Практически во всех натуральных пищевых продуктах содержатся и потенциально опасные для организма человека факторы. Характер их различен, как и их влияние на здоровье человека.

Токсичные вещества пищи можно разделить на следующие группы: биологические, химические и природные. Токсичность – это свойство веществ, действуя на биологические системы немеханическим способом, вызывать их повреждение или гибель.

Существуют две основные характеристики токсичности - ЛД50 и ЛД100. ЛД - аббревиатура летальной дозы, т. е. дозы, вызывающей при однократном введении гибель 50 или 100 % экспериментальных животных. Дозу обычно определяют в размерно-

53

сти концентрации. Токсичными считают все те вещества, для которых ЛД мала (табл. 1).

Величина t0,5 характеризует время полувыведения токсина и продуктов его превращения из организма и может составлять от нескольких часов до нескольких десятков лет.

При хронической интоксикации решающее значение приобретает способность вещества проявлять кумулятивные свойства, т. е. накапливаться в организме и передаваться по пищевым цепям. Необходимо также учитывать комбинированное действие нескольких чужеродных веществ при одновременном и последовательном поступлении в организм и их взаимодействие с макро- и микронутриентами пищевых продуктов (т. к. человек может получать в течение всей жизни вместе с пищей целый комплекс чужеродных веществ либо в виде контаминантов-загрязнителей, либо в виде добавок к пищевым продуктам).

В связи с хроническим воздействием посторонних веществ на организм человека и возникающей опасностью отдаленных последствий важнейшее значение приобретают канцерогенное (возникновение злокачественных опухолей), мутагенное (качественные и количественные изменения в генетическом аппарате клетки) и тератогенное (аномалии в развитии плода, вызванные структурными, функциональными и биохимическими изменениями в организме матери и плода) действия ксенобиотиков.

На основе токсикологических критериев (с точки зрения гигиены питания) международными организациями ООН - ВОЗ,

54

ФАО и др., а также органами здравоохранения отдельных государств приняты следующие базисные (основные) показатели: ПДК, ДСД и ДСП.

ПДК (предельно допустимая концентрация) - это такая концентрация, которая при ежедневном воздействии в течение сколь угодно длительного времени не может вызывать заболеваний или отклонений в состоянии здоровья, обнаруживаемых современными методами исследований, в жизни настоящего и последующих поколений.

ДСД (допустимая суточная доза) - ежедневное поступление вещества, которое не оказывает негативного влияния на здоровье человека в течение всей жизни.

ДСП (допустимое суточное потребление) - величина, рассчитываемая как произведение ДСД на среднюю величину массы тела (60 кг).

Биологические токсины.Контаминация продуктов питания гельминтами, простейшими, бактериями, вирусами, прионами определяется как биологический фактор заражения пищи. По данным ВОЗ, пищевые токсикоинфекции в 22 % случаев связаны с микробной контаминацией яиц и яичных продуктов (только при употреблении сырых яиц), в 13 % - пирожных и мороженого, в 15 % - мяса и мясных продуктов, в 8 % - молока и молочных продуктов.

Staphylococcus aureus – грамположительные бактерии, являются причиной стафилококкового пищевого отравления. Продуцируют семь энтеротоксинов: А, В, С1, С2, D, Е, которые представляют собой полипептиды с молекулярной массой 2636028500 Да. Энтеротоксины S. aureus термостабильны и инактивируются лишь после 2-3-часового кипячения. Бактерицидным действием по отношению к стафилококкам характеризуются уксусная, лимонная, фосфорная, молочная кислоты при рН до 4,5. Жизнедеятельность бактерий прекращается при концентрации поваренной соли (NaCl) – 12 %, сахара - 60-70 %, вакуумная упаковка также ингибирует рост бактерий.

Наиболее благоприятной средой для роста и развития стафилококков являются молоко, мясо и продукты их переработки, а

55

также кондитерские кремовые изделия, в которых концентрация сахара составляет менее 50 %. Стафилококковые энтеротоксины являются причиной 2745 % всех пищевых токсикоинфекций.

Clostridium botulinum продуцирует токсины, представляющие особую опасность для человека. Эти микроорганизмы являются облигатными анаэробами с термостабильными спорами. Различают А, В, С, D, E, F и G виды ботулотоксинов, причем наибольшей токсичностью обладают токсины А и Е. Ботулотоксины имеют белковую природу, молекулярная масса порядка 150 кДа.

Они поражают рыбные, мясные продукты, фруктовые, овощные и грибные консервы при недостаточной тепловой обработке и в условиях резкого снижения содержания кислорода (герметично закупоренные консервы). Ботулотоксины характеризуются высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов, кислот, низких температур, но инактивируются под влиянием щелочей и высоких температур (80 °С - 30 мин; 100 °С - 15 мин).

Ботулизм встречается довольно часто (500-600 случаев в год), летальность достигает порядка 7-9 %.

К токсинообразующим микроорганизмам, вызывающим пищевые отравления у человека, относятся также Clostridium perfringens - спорообразующие анаэробные грамположительные бактерии, которые продуцируют большое число энтеротоксинов.

Патогенные штаммы Escherichia coli являются продуцентами термостабильных токсинов полипептидной природы с молекулярной массой от 4 до 10 кДа и способны вызывать как острые токсиноинфекции, так и являться причиной хронической интоксикации и почечной недостаточности.

Заражение многими гельминтами и простейшими также происходит пищевым путем.

Отмечается непрерывная изменчивость микроорганизмов, в результате чего меняется их чувствительность к антимикробным факторам, осваиваются новые экологические ниши, изменяются патогенность и вирулентность.К числу стремительно распростра-

56

няющихся микроорганизмов, передающихся пищевым путем,

относится Campylobacter jejuni.

Возбудитель ботулизма освоил новую среду обитания – вакуумную упаковку. Появились новые вирулентные штаммы сальмонелл и кишечной палочки, вызывающие отдаленные внекишечные осложнения и устойчивые к современным антибактериальным средствам. Установлено, что разные виды бактерий могут обмениваться между собой генами устойчивости к антибиотикам.

Важной проблемой является микотоксикоз. Микотоксины (от греч. mukes - гриб и toxicon - яд) - это вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими свойствами. Они не являются эссенциальными для роста и развития продуцирующих их микроорганизмов.

В настоящее время из кормов и продуктов питания выделено около 250 видов плесневых грибов, большинство из которых продуцирует высокотоксичные метаболиты, в том числе около 120 микотоксинов. Предполагают, что с биологической точки зрения микотоксины выполняют в обмене веществ микроскопических грибов функции, направленные на выживание и конкурентоспособность в различных экологических нишах.

С гигиенических позиций - это особо опасные токсические вещества, загрязняющие корма и пищевые продукты. Высокая опасность микотоксинов выражается в том, что они характеризуются токсическим эффектом в чрезвычайно малых количествах и способны весьма интенсивно диффундировать в глубь продукта.

Афлатоксины представляют собой одну из наиболее опасных групп микотоксинов, обладающих сильными канцерогенными свойствами, которая включает четыре основных представителя (афлатоксины В1, В2, G1, G2) и еще более 10 соединений, являющихся производными или метаболитами основной группы

(М1, М2, В2а, G2a, GM1, Р1, Q1 и другие). Продуцентами афлатоксинов являются некоторые штаммы 2 видов микроскопических

грибов: Aspergillus flavus (Link.) и Aspergillus parasiticus (Speare).

По своей химической структуре эти вещества являются фурокумаринами:

57

Афлатоксин М1

Физико-химические свойства афлатоксинов.Они характе-

ризуются способностью сильно флуоресцировать при воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения. Афлатоксины В1 и В2 обладают сине-голубой флуоресценцией, G1 и G2 - зеленой флуоресценцией, М1 и М2 - сине-фиолетовой. Это свойство лежит в основе практически всех физико-химических методов их обнаружения и количественного определения.

58

Афлатоксины слаборастворимы в воде (10-20 мкг/см3), нерастворимы в неполярных растворителях, но легко растворяются

врастворителях средней полярности таких, как хлороформ, метанол и др.

Вхимически чистом виде они относительно нестабильны и чувствительны к действию воздуха и света, особенно к ультрафиолетовому облучению. Растворы афлатоксинов стабильны в хлороформе и бензоле в течение нескольких лет при хранении в темноте и на холоде. Эти вещества практически не разрушаются

впроцессе обычной кулинарной и технологической обработки загрязненных пищевых продуктов.

Факторы, влияющие на токсинообразование. Продуценты афлатоксинов - микроскопические грибы рода Aspergillus могут достаточно хорошо развиваться и образовывать токсины на различных естественных субстратах (продовольственное сырье, пищевые продукты, корма), причем не только в странах с тропическим и субтропическим климатом, как полагали ранее, но практически повсеместно.

Оптимальной температурой для образования токсинов является температура 27-30 °С, хотя синтез афлатоксинов возможен и при более низкой (12-13 °С) или при более высокой (40-42 °С) температуре.

Максимальный синтез токсинов наблюдается обычно при влажности воздуха выше 18 % для субстратов, богатых крахмалом (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, кукуруза, сорго), и выше 9-10 % - для субстратов с высоким содержанием липидов (арахис, подсолнечник, семена хлопчатника, различные виды орехов). При относительной влажности атмосферного воздуха ниже 85 % синтез афлатоксинов прекращается.

Биологическое действие афлатоксинов. Действие афлаток-

синов на организм животных и человека может быть охарактеризовано с двух позиций. Во-первых, с точки зрения острого токсического действия и, во-вторых, с точки зрения оценки опасности отдаленных последствий. Острое токсическое действие афлатоксинов связано с тем, что они являются одними из наиболее сильных гепатропных ядов. Отдаленные последствия действия афла-

59

токсинов проявляются в виде канцерогенного, мутагенного и тератогенного эффектов.

Механизм действия афлатоксинов. Афлатоксины или их активные метаболиты действуют практически на все компоненты клетки. Афлатоксины нарушают проницаемость плазматических мембран. В ядрах они связываются с ДНК, ингибируют репликацию ДНК, ингибируют активность ДНК-зависимой-РНК- полимеразы - фермента, осуществляющего синтез матричной РНК, и тем самым подавляют процесс транскрипции. В митохондриях афлатоксины вызывают повышение проницаемости мембран, блокируют синтез митохондриальных ДНК и белка, нарушают функционирование системы транспорта электронов, вызывая энергетический голод клетки. В эндоплазматическом ретикулуме под воздействием афлатоксинов наблюдаются патологические изменения: ингибируется белковый синтез, нарушается регуляция синтеза триглициридов, фосфолипидов и холестерина. Афлатоксины оказывают прямое действие на лизосомы, что приводит к повреждению их мембран и высвобождению активных гидролитических ферментов, которые расщепляют клеточные компоненты.

Все вышеперечисленные нарушения приводят к так называемому метаболистическому хаосу и гибели клетки.

Одним из важных доказательств реальной опасности афлатоксинов для здоровья человека явилось установление корреляции между частотой и уровнем загрязнения пищевых продуктов афлатоксинами и частотой первичного рака печени среди населения.

Согласно данным ВОЗ, человек при благоприятной гигиенической ситуации потребляет с суточным рационом до 0,19 мкг афлатоксинов. В России приняты следующие санитарногигиенические нормативы по афлатоксинам: ПДК афлатоксина В, для всех пищевых продуктов, кроме молока, составляет - 5 мкг/кг, для молока и молочных продуктов - 1 мкг/кг (для афлатоксина М1 - 0,5 мкг/кг). Допустимая суточная доза (ДСД) - 0,005-0,01 мкг/кг массы тела.

60