Современные методы исследования свойств сырья и продуктов животного происхождения. Лабораторный практикум. Учебное пособие

кости или различной стабильности образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной – газ.

Разделение основано на различиях в летучести и растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси.

Этот метод можно использовать для анализа газообразных, жидких и твёрдых веществ с молекулярной массой меньше 400, которые должны удовлетворять определённым требованиям, главные из которых – летучесть, термостабильность, инертность, лёгкость получения. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому газовую хроматографию широко используют как серийный метод анализа органических соединений.

Газохроматографическое разделение и анализ осуществляются в специальном приборе - газовом хроматографе (рис. 1).

Рис. 1.Схема газового хроматографа: 1 – источник газа-носителя (подвижнойфазы); 2 – регулятор расхода газа-носителя; 3 – устройство вводапробы; 4 – хроматографическая колонка в термостате; 5 – детектор;6 – электронный усилитель; 7 – регистрирующий прибор (самописец,компьютер); 8 – расходомер

В ходе эксперимента газ-носитель из баллона повышенного давления непрерывно поступает в блок подготовки, где дополнительно очищается. Устройство для ввода пробы обычно пред-

21

ставляет собой проточную независимо термостатируемую цилиндрическую камеру. Анализируемая проба (1-10 мкдм3) вводится в

поток газа при повышенной температуре дозатором (шприцем) через резиновую термостойкую мембрану.

Существуют также автоматические системы ввода проб (самплеры). Жидкая проба быстро испаряется и потоком газа переносится в хроматографическую колонку, находящуюся в термостате. Разделение обычно проводят при 20-400 °С, но иногда (в основном при разделении изотопов низкокипящих газов) при значительно более низких температурах – до температуры кипения жидкого азота.

Для аналитического разделения используют насадочные колонки длиной 0,5-5 м и диаметром 0,2-0,6 см, а также капиллярные полые колонки длиной 10-100 м и диаметром 0,1-1 мм, и капиллярные насадочные колонки длиной 0,1-20 м. Насадкой служат твердый сорбент с развитой поверхностью (50-500 м2/г) или твердый макропористый носитель с удельной поверхностью 0,2-2,0 м2/г, на которую тонким слоем нанесена нелетучая жидкость – неподвижная жидкая фаза. Масса жидкой фазы составляет обычно 2-20 % от массы носителя. Средний диаметр частиц сорбента – 0,1-0,4 мм (колонку заполняют близкими по размеру частицами). Применяют также (обычно в капиллярных насадочных колонках) микронасадки с диаметром частиц сорбента 10-50 мкм.

Зоны разделенных компонентов в потоке газа поступают в детекторы хроматографические. В газовой хроматографии используются практически только дифференциальные детекторы (катарометр, пламенно-ионизационный, электронно-захватный, пламенно-фотометрический). Регистратор записывает изменение сигнала во времени. Полученная диаграмма называется хроматограммой (рис. 2).

Время удерживания компонента – это период от момента ввода в колонку анализируемой пробы до момента выхода (максимум пика). Размер пика на хроматограмме прямо пропорционален количеству анализируемого вещества, что позволяет проводить количественный анализ.

22

Рис. 2. Образцы хроматограмм

I. Получение метиловых (этиловых) эфиров жирных кислот из триглицеридов переэтерификацией с метанольным (этанольным) раствором метилата (этилата) натрия по ГОСТ Р 51486.

Приготовление абсолютного метанола (этанола). В колбу вместимостью 500 см3 взвешивают (30±1) г окиси кальция, добавляют 250 см3 метанола (этанола) и кипятят с обратным холодильником типа XIII в течение 6-8 ч. Затем метанол перегоняют при температуре 64,7 °С (этанол при температуре 78,3 °С).

Приготовление раствора метилата натрия в метаноле (этилата натрия в этаноле) молярной концентрации 2

моль/дм3.Взвешивают 2,7 г метилата натрия (3,4 г этилата натрия) или 1,15 г металлического натрия в стаканчике для взвешивания с точностью до 0,01 г.

В мерную колбу вместимостью 25 см3 наливают 10-12 см3 абсолютного метанола (абсолютного этанола) и растворяют в нем

23

метилат натрия или нарезанный маленькими кусочками металлический натрий, который добавляют небольшими порциями. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доливают абсолютным метанолом (абсолютным этанолом) до метки. Раствор хранят в холодильнике.

Приготовление метиловых (этиловых) эфиров жирных ки-

слот. Лабораторную пробу жидкого растительного масла или предварительно расплавленного твердого растительного масла или животного жира тщательно перемешивают.Отобранную от лабораторной пробы навеску растительного масла или животного жира массой 0,1 г помещают в стеклянную пробирку и растворяют в 1,9 см3 гексана.

Лабораторную пробу маргариновой продукции массой (100±5) г в стеклянном стаканчике помещают в сушильный шкаф при температуре 40-45 °С и выдерживают до полного расслоения. Верхний жировой слой сливают, фильтруют через бумажный фильтр и хорошо перемешивают. Взвешивают навеску жировой фазы массой 0,1 г в стеклянную пробирку и растворяют в 1,9 см3 гексана.

В гексановый раствор вводят 0,1 см3 раствора метилата натрия в метаноле (этилата натрия в этаноле) молярной концентрации 2 моль/дм3. После интенсивного перемешивания в течение 2 мин реакционную смесь отстаивают 5 мин и фильтруют через бумажный фильтр. При наличии метиловых (этиловых) эфиров жирных кислот с числом атомов углерода в цепи менее 8 фильтрацию заменяют центрифугированием. Полученный раствор готов к употреблению.

II. Подготовка оборудования и проведение качественного и количественного состава жирных кислот в виде метиловых эфиров.

Приготовление стандартной смеси. В качестве стандарт-

ной смеси используют смесь метиловых эфиров чистых жирных кислот, в том числе промышленно изготовленные смеси или смесь метиловых эфиров жирных кислот жира известного состава, близкого к исследуемым жировым веществам (например, масло какао или подсолнечное масло).

24

Выбор и подготовка аналитической колонки. Для опреде-

ления жирных кислот с числом атомов углерода более 20 используют относительно короткую насадочную колонку, для жирных кислот с числом атомов углерода 4 и 6 используют насадочную колонку длиной 2 м.

Если присутствуют полиненасыщенные кислоты с более чем тремя двойными связями, не рекомендуется использовать колонки из нержавеющей стали без необходимой проверки, так как эти соединения могут разрушаться в таких колонках.

Проведение измерения. Включение и работа с хроматографом в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

Выбороптимального эксплуатационного режима. При вы-

боре условий измерений с насадочной колонкой учитывают следующие переменные величины:

-длину и внутренний диаметр колонки;

-природу и количество неподвижной фазы;

-температуру колонки;

-поток газа-носителя;

-требуемую разрешающую способность;

-размер испытуемой пробы, взятой так, чтобы получить линейную характеристику;

-продолжительность анализа.

Хроматографирование продолжают при постоянной температуре до полного элюирования всех компонентов.

При отсутствии в приборе программированного нагрева хроматографирование проводят при двух температурах: 100 и 185 °С.

Кроме того, на хроматографе устанавливают следующие параметры для проведения измерения (если позволяют характеристики прибора): температура инжектора - 200-230 °С; температура детектора равна или выше температуры колонки; отношение объемной скорости потока водорода, подаваемого в пламенноионизационный детектор, к скорости потока газа-носителя составляет от 1:2 до 1:1 в зависимости от диаметра колонки; поток воздуха или кислорода в 5-10 раз больше потока водорода.

25

В капиллярных колонках разделение компонентов и продолжительность анализа зависят от объемной скорости потока газа-носителя в колонке. Выбор скорости зависит от того, что хотят получить - хорошее разделение или сократить время испытания.

Проба для проведения измерения. Отбирают микрошприцем от 0,1 до 2 мм3 раствора метиловых эфиров жирных кислот, приготовленных из испытуемой пробы по ГОСТ Р 51486 и вводят в

колонку.

Если эфиры не в растворе, то готовят раствор концентрации 100 мг/см3 в гептане (или гексане) и вводят в колонку от 0,1 до 1 мм3 этого раствора. При определении компонентов, присутствующих в малых количествах, концентрацию вводимой пробы увеличивают в 10 раз.

Получение хроматограммы стандартной смеси и по-

строение графиков. Проводят измерение стандартной смеси в изотермических условиях, идентичных проведению измерения метиловых эфиров жирных кислот испытуемой пробы. Измеряют объемы удерживания метиловых эфиров жирных кислот. Строят графики логарифмической зависимости объема удерживания от числа атомов углерода в цепи для метиловых эфиров жирных кислот любой степени ненасыщенности.

Графики для кислот с прямой цепью одинаковой степени ненасыщенности будут в виде прямых, приблизительно параллельных линий (рис. 3).

Необходимо исключить условия, недостаточные для разделения двух компонентов, "скрытые пики". Например, в испытуемой пробе одновременно присутствуют жирные кислоты С18:3 и

С20:0 или С18:3 и C18:2 с сопряженными связями, то проводят измерение на двух неподвижных фазах с различными полярностями,

чтобы убедиться в отсутствии скрытых пиков.

Для капиллярных колонок идентификацию проводят сравнением со стандартной смесью, содержащей, в том числе, изомеры ненасыщенных кислот.

26

,(1)

где Ai – площадь пика метилового эфира каждой жирной кислоты

(i), мм2;

ΣAi – сумма площадей всех пиков метиловых эфиров жирных кислот, мм2.

Вычисление проводят с точностью до второго десятичного знака, с последующим округлением до первого десятичного знака.

Для особо точных измерений для определения массовой доли метиловых эфиров жирных кислот с числом атомов углерода менее 8 или в присутствии метиловых эфиров жирных кислот со вторичными группами вводят поправочные коэффициенты. Поправочные коэффициенты рассчитывают на основании результатов измерений стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот известного состава, проведенных в условиях, идентичных условиям измерений анализируемой пробы.

Массовую долю метилового эфира каждой жирной кислоты в стандартной смеси Xri, %, вычисляют по формуле

где mri – масса метилового эфира каждой жирной кислоты (i) в стандартной смеси, мг;

Σmri – сумма масс метиловых эфиров жирных кислот стандартной смеси, мг.

По хроматограмме стандартной смеси и по формуле (1) вычисляют полученную массовую долю метилового эфира каждой жирной кислоты (i) в стандартной смеси в процентах.

Затем вычисляют поправочный коэффициент Ki для метилового эфира жирной кислоты (i), в стандартной смеси по формуле

28

- относительный поправочный коэффициент метилового эфира жирной кислоты (i) (по отношению к );

- относительный поправочный коэффициент для внут-

реннего стандарта (по отношению к );

- масса пробы, взятая для измерения, мг;

- масса внутреннего стандарта, мг.

Вычисление проводят с точностью до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Расхождение между результатами двух независимых единичных определений, выполненных при использовании одного метода, на идентичном испытуемом материале, в одной лаборатории, одним аналитиком, на одном оборудовании, за короткий промежуток времени, не должно превышать при доверительной вероятности 0,95 %:

-0,2 (абсолютное значение) при содержании искомых веществ менее 5%;

-1 (абсолютное значение) и 3 по отношению к среднему значению двух результатов при содержании искомых веществ, равном или более 5%.

Расхождение между результатами двух единичных определений, выполненных одним методом, на идентичном испытуемом материале, в разных лабораториях, разными аналитиками, на различном оборудовании, не должно превышать при доверительной вероятности 0,95 %:

-0,5 (абсолютное значение) при содержании искомых веществ менее 5%;

-3 (абсолютное значение) и 10 по отношению к среднему значению двух результатов при содержании искомых веществ, равном или более 5 %.

III. Идентификация натуральности сливочного масла. Натуральность сливочного масла устанавливают по содер-

жанию кислот и их соотношению (табл. 2,3,4).

30