Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов

различие в опытной и контрольной группах являются статистически значимым и воспроизводимым.

3. Методика оценки стимуляции неспецифической резистентности

Для оценки стимуляции неспецифической резистентности изучаемый препарат вводят внутрибрюшинно или подкожно в различных дозах мышам линии СВА или Fl (CBA/C57 black). Наиболее часто используются дозы 1000 мкг, 100 мкг, 10 мкг в объеме 0,5 мл физиологического раствора. Контрольные мыши получают 0,5 мл физиологического раствора. Через 48-72 часа одну группу опытных и контрольных мышей заражают внутрибрюшинно 1-2 DсL (dosis certae letalis - абсолютная летальная доза) Staphylococcus aureus, другую группу Е. coli. Наблюдения за животными ведут в течение 10 дней. Опыт можно учитывать только в том случае, если в контрольной группе гибель животных будет составлять не менее 90%. По данным этого опыта препарат можно рассматривать как иммунотропное средство (ИТС), если он, по крайней мере, в дозах 100 мкг и 10 мкг обеспечивает 60% и выше выживание мышей.

Методика определения DcL (абсолютная летальная доза) и LD50 (половинная летальная доза). Стерильным физраствором смывают суточную агаровую культуру P. Multocida (E. сoli), взвесь бактерий пипеткой переносят в стерильную пробирку, добавляя в нее физраствор, чтобы довести концентрацию бактерий до 1 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Затем из этой взвеси готовят последовательные двукратные разведения на стерильном физрастворе. 500 млн, 250, 125 и т.д., в зависимости от предполагаемой вирулентности микроорганизма. Взвесь 0,5 мл вводят внутрибрюшинно или подкожно 5 мышам. Животных метим краской и в течение 10 дней наблюдаем за их состоянием, отмечая количество павших. Результаты заносят в протокол испытаний.

3.1. Оценка влияния препарата на фагоцитоз

Для оценки влияния препарата на фагоцитоз используют мышей через 24-48 часов после введения им исследуемой дозы препарата. Для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов мышам вводят внутрибрюшинно 0,5- 1,0 мл 2-3% раствора пептона и через 2 часа их умерщвляют с помощью хлороформа. Животных вскрывают в асептических условиях. Из брюшной

41

полости с помощью пастеровской пипетки отсасывают жидкость, помещают ее в силиконизированные центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. После завершения центрифугирования, пробирки вынимают, из них удаляют надосадочную жидкость. Осадок ресуспендируют средой 199, подсчитывают число нейтрофилов в камере Горяева и доводят их до концентрации 1-2 млн/мл.

Одновременно, бактерии также опсонизируют мышиной сывороткой. Опсонизацию бактерий проводят в течение 10 мин при температуре 37°С с последующим отмыванием стерильным физиологическими раствором. К суспензии нейтрофилов добавляют равный объем бактерии, чаще всего стафилококк не содержащий А белок, в соотношении 1:10 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубации готовят по аналогии с кровяным, мазок на предметном стекле, фиксируют его метанолом 20 мин и красят краской Романовского-Гимза в течение 30 - 40 мин.

Для изучения фагоцитарной активности макрофагов используют пептон. Обычно его вводят в брюшную полость мыши. На 3-4-е сутки после введения пептона, мышей умерщвляют с помощью хлороформа. В асептических условиях вскрывают и вводят внутрибрюшинно 3-4 мл среды 199 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. После легкого массажа брюшной стенки жидкость отсасывают с помощью пастеровской пипетки. Полость можно промывать средой 199 несколько раз, объединяя в одну посуду все полученные порции. Далее исследование ведется, как и в опытах с нейтрофилами.

Учет результатов осуществляется микроскопией мазка (объектив х90), подсчитывают количество фагоцитирующих макрофагов, фагоцитарное число поглощенных бактерии на 1 макрофаг и высчитывают фагоцитарный индекс, процент фагоцитирующих макрофагов.

Для оценки влияния испытуемого препарата на фагоцитоз, in vitro берут цельную кровь из вены в пробирку с гепарином, из расчета 25 единиц на 1-2 мл исследуемой крови. Затем эту кровь смешивают с 0,8 мл 3% раствора желатина, приготовленного на среде 199. Полученную смесь ставят в термостат на 20-30 мин при 37°С. После инкубации, из центрифужной пробирки отсасывают надосадочный слой, содержащий

42

все белые клеточные элементы. Клетки 2 раза отмывают средой 199 при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку после последнего центрифугирования добавляют 1 мл среды 199.

Затем готовят на среде 199 клеточную суспензию, содержащую 2 млн нейтрофилов на 1 мл. Параллельно с этим готовят взвесь Staphylococcus aureus. Для опыта целесообразно использовать штамм стафилококка в концентрации 20 млн/мл, не содержащий А белок. Стафилококк предварительно должен быть опсонизирован пуловой сывороткой (смесь сыворотки от разных животных) крупного рогатого скота в течение 20 мин при 37°С и тщательно отмыть средой 199. Суспензию нейтрофилов и Staphylococcus aureus аккуратно смешивают в камере Горяева, с применением краски С.И. Задорожного и И.М. Дозморова (0,01% раствор азура II в 0,05% растворе тритона Х-100), считают число фагоцитировавших нейтрофилов.

При постановке реакции в 96-луночных круглодонных планшетах смешивают 90 мкл клеточной суспензии нейтрофилов и 90 мкл стафилококка в соотношении 1:10. Затем планшеты инкубируют в термостате при 37°С в течение 30-60 мин. Для изучения исследуемого препарата к смеси добавляют по 20 мкл этого вещества в соответствующих концентрациях. В контроле к смеси добавляют 20 мкл среды 199. После окончания инкубации планшеты центрифугируют при 200 g 10 мин, надосадочную жидкость удаляют. Из осадка готовят препараты по методике, представленной ранее, и проводят подсчет фагоцитирующих клеток. Способность исследуемого препарата влиять на поглотительную стадию фагоцитоза оценивают по фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу.

4.Оценка проаллергического/противоаллергического и аллергизирующего действия препаратов

Целью использования методов, изложенных в настоящем разделе, является установление возможного влияния препаратов на экспериментальные модели аллергии. Вполне вероятно, что новые препараты (в частности, иммунотропные) могут усиливать/потенцировать (или тормозить) аллергические реакции. Если есть основания предполагать такие свойства у нового фармакологического соединения (препарата), то используются методы из числа приведенных ниже. Подбор рекомендуемых

43

методов осуществлен таким образом, чтобы составить впечатление о действии препарата на интегральные модели аллергического ответа или на составляющие его звенья. В случае выявления тормозящего действия препарата на аллергический ответ этот препарат может рассматриваться как потенциальное противоаллергическое средство. В отдельном подразделе описаны подходы, используемые для суждения о наличии аллергизирующих (сенсибилизирующих) свойств у исследуемого препарата.

4.1. Оценка системной анафилаксии (анафилактический шок)

Для получения активного анафилактического шока морских свинок предварительно сенсибилизируют подкожно, каким либо чужеродным белком. Наиболее доступным является использование с этой целью нормальной лошадиной сыворотки. Однократное подкожное введение 0,1 мл сыворотки обеспечивает высокий уровень сенсибилизации. Для получения анафилактического шока на 14-21 день после первичной инъекции белка свинкам 2 групп внутрисердечно или внутривенно вводят 0,1-0,5 мл лошадиной сыворотки (разрешающая инъекция).

Доза антигена подбирается опытным путем. Реакция обычно наступает через 1 -2 мин. Оценка реакции проводится по четырех плюсной схеме:

+ - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти падение температуры тела (не менее чем на 1оС),

++ - четко выраженные частые почесывания, единичные чихания, падение температуры тела,

+++ - спастический кашель, боковое положение животного, отделение кала и мочи,

++++ - спазм дыхательных путей, конвульсивные прыжки, судороги, животное погибает (как правило, на 5 мин).

4.2. Продукция аллерген-специфических

IgE и IgG антител in vivo

Наиболее подходящим и доступным объектом являются мыши F1 (СВА х C57BL) массой 18-20 г. В качестве антигена используют не менее чем трижды перекристаллизованный овальбумин куриных яиц.

В зависимости от целей, определяемых характером используемого фармакологического препарата, сенсибилизацию мышей осуществляют в одном из трех режимов, обеспечивающих преимущественную продукцию IgE антител, продукцию IgE и IgG антител.

44

Для первой иммунизации доза овальбумина составляет 0,5 мкг/ мышь, второго - 10 мкг/мышь, третьего - 100 мкг/мышь. При проведении первой иммунизации lgE-ответ может быть зарегистрирован лишь после реиммунизации. После третьей инъекции титры IgE антител возрастают, превышая титры появляющихся к этому времени lgG антител. Сенсибилизирующие дозы овальбумина: 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь позволяют получить lgE-ответ уже после первой сенсибилизирующей инъекции. При использовании дозы овальбумина 100 мкг/мышь в ответ на реиммунизирующие инъекции увеличение титров IgG антител сопровождается заметным уменьшением титров IgE антител.

Сенсибилизацию мышей проводят повторными инъекциями овальбумина с интервалом в 4 недели (допустимо сокращение интервалов до 3 недель). Овальбумин вводят внутрибрюшинно с 0,5 мг А1(ОН)3 (при дозе овальбумина 0,5 мкг/мышь и 10 мкг/мышь) или с 5 мг А1(ОН)3 (при дозе овальбумина 100 мкг/мышь) в 0,5 мл физиологического раствора. В серии испытаний используют не менее 5 мышей. Кровь для оценки кинетики образования антител получают в определенные сроки сенсибилизации из ретроорбитального синуса. Титры IgE антител определяют на нелинейных крысах-самцах в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титры IgG антител определяют в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) на нелинейных мышах или иммуноферментным методом. Для воспроизведения ПКА сыворотку крови иммунизированных мышей в необходимых разведениях вводят в объеме 30 мкл внутрикожно в область спины. На мышах оптимальным является использование лишь 6 точек введения сыворотки крови. Разрешающую дозу овальбумина (0,5 мг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса «Serva») вводят мышам в хвостовую вену через 2 часа после внутрикожного введения сыворотки. В остальном процедура проводится так же как и при постановке реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) на крысах.

4.3. Пассивная кожная анафилаксия (ПКА)

Наиболее распространенным и доступным приемом воспроизведения иммунологической реакции этого типа является ПКА крыс (no Z. Ovary), кожа которых пассивно сенсибилизирована сывороткой крови активно сенсибилизированных мышей, содержащей аллерген-специфический IgE.

45

Для опытов используют нелинейных крыс-самцов массой 250 г. Животным под эфирным наркозом строго внутрикожно в область живота вводят микрошприцом по 30 мкл физиологического раствора и по 30 мкл последовательных двукратных разведении (начиная с разведения 1:4) пула сывороток мышей содержащего аллерген-специфический (антиовальбуминовый) IgE. Разрешающую инъекцию овальбумина делают крысам в хвостовую вену через 24 часа после пассивной сенсибилизации кожи. Антиген вводят под поверхностным эфирным наркозом из расчета 100 мкг овальбумина на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса («Serva») на физиологическом растворе. Интенсивность ПКА оценивают через 30 мин, по прокрашиванию участков кожи. Для этого животных забивают под эфирным наркозом перерезкой сонных артерий, кожу отпрепаровывают и выраженность реакции определяют по площади прокрашенного участка, измеряемой на внутренней поверхности кожи.

4.4. Анафилаксия изолированных органов

В качестве моделей анафилаксии изолированных органов может быть использована пассивная и активная анафилаксия изолированных гладкомышечных органов лабораторных или крупных животных. Анафилактическую реакцию в этом случае оценивают по сократительному эффекту в условиях изометрической регистрации напряжения мышц с соблюдением контроля сократительной реакции на действие подходящего для данного объекта медиатора (гистамина, ацетилхолина, цистеиновых лейкотриенов и пр.). Анафилаксия изолированных органов может быть также оценена на модели активной или пассивной анафилактической реакции изолированной легочной ткани животных характеризуемой по вызванному антигеном высвобождению из нее предсуществующих или вновь образуемых медиаторов аллергии (гистамина, триптазы, цистеиновых лейкотриенов; фактора, активирующего тромбоциты).

Наиболее доступным объектом является активная анафилаксия изолированных гладкомышечных органов морской свинки. Предпочтение в этом случае отдается изолированным препаратам подвздошной кишки, так как можно получить достаточно большое число отрезков кишечника для проведения сравнительных испытаний в одном опыте на нескольких образцах гладкомышечного органа одного и того же животного.

46

Морских свинок не менее чем трижды иммунизируют перекристаллизованным овальбумином. Овальбумин вводят трехкратно через день в виде смеси состоящей из 0,25 мл физиологического раствора, содержащего 5 мг овальбумина, и 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда. Первую инъекцию проводят подкожно в область задней конечности; две последующие - внутримышечно в область бедра. Опыты ставят через 3-4 недели после последней сенсибилизирующей инъекции. Описанный способ подготовки животных дает 100% сенсибилизацию животных и их гладкомышечных органов.

Для подготовки отрезков кишечника животных под эфирным наркозом забивают кровопусканием из сонных артерий. Затем вскрывают брюшную полость, обнажают подвздошную кишку, которую отсекают вблизи илеоцекального угла. Подвздошную кишку освобождают от брыжейки и вырезают отрезки длиною около 5-6 см, которые промывают при помощи шприца жидкостью Кребса (состав г/л: NaCl 6.92+KCl 0.35+CaCl2

0.28+NaHCO3 0.1+KH2PO4 0.16+MgSO4·7H2O 0.29+ глюкоза 1,0) при комнатной температуре.

Из промытых отрезков получают более короткие (1,5-2 см), которые прошивают с обоих концов шелковыми нитками. До момента использования отрезков в опыте их сохраняют в жидкости Кребса при температуре 4оС. Интервал времени между взятием отрезков кишечника и испытанием их в опыте может составить до 8 часов (контролированный интервал).

Испытуемый отрезок помещают в ванночку для изолированных органов (наиболее удобный объем - 20 мл), укрепляя один конец на полом стеклянном крючке, через который поступает в ванночку кислород. Второй конец прикрепляют к датчику для регистрации напряжения мышцы. Опыты проводят в условиях постоянной перфузии органа жидкостью Кребса со скоростью около 2 мл/мин с обеспечением возможности переключения перфузии на жидкость содержащую испытуемые препараты.

47

4.5. Анафилактическая секреция гистамина в тучных клетках и базофилах животных in vitro

Принцип метода определения высвобождения гистамина из тучных клеток крыс и мышей состоит в том, что смешанную клеточную взвесь, полученную из брюшной и плевральной полостей, или выделенные из нее тучные клетки инкубируют в присутствии испытываемого агента при определенной температуре (если не изучается зависимость эффекта от температуры, то температурный режим соответствует 37оС) и времени инкубации.

Клетки осаждают центрифугированием; надосадочную жикость отделяют, а клетки лизируют добавлением к ним дистиллированной воды. Затем раздельно определяют флуориметрическим методом содержание гистамина в осадочных и надосадочных порциях. Поскольку высвобожденный гистамин находится в несвязанном состоянии и в лизатах клеток отсутствуют компоненты вмешивающиеся в реакцию определения гистамина, то не требуются предварительные этапы экстракции и очистки гистамина. Высвобождение гистамина выражают в процентах к его общему содержанию в каждой порции клеток.

Принцип метода определения высвобождения гистамина из базофилов периферической крови животных состоит в том, что обогащенную базофилами (до 2-4%) взвесь лейкоцитов периферической крови инкубируют в присутствии испытываемого агента при определенной температуре и продолжительности инкубации. Клетки осаждают центрифугированием; надосадочную жидкость удаляют, а в осадках клеток определяют остаточный гистамин микрофлуориметрическим методом. Освобождение от примеси эритроцитов позволяет исключить многоэтапные процедуры экстракции и очистки гистамина.

Микроспектрофлуориметрический вариант метода определения гистамина имеет высокую чувствительность, достаточную для определения гистамина в базофилах, Необходимость использования такого варианта связана с низким содержанием гистамина в базофилах (до 2 мкг на 1 миллион базофилов). Однако микроспектрофлуориметрический вариант не позволяет определить очень низкие концентрации гистамина в надосадочных жидкостях содержащих белок. Поэтому уровень высвобождения гистамина

48

оценивают сравнением образцов, содержащих испытываемый агент с контрольными образцами клеток.

В специальных предварительных опытах изучают возможность вмешательства изучаемого фармакологического средства в реакцию определения гистамина, проводят пробы на параллельность калибровочных кривых [4,5].

4.6. Оценка аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия препаратов

4.6.1. Оценка общей анафилактической активности

Морским свинкам вводят исследуемый препарат по следующей схеме: сенсибилизирующие инъекции первая инъекция подкожно две последующие внутримышечно через день в область бедра. Разрешающая инъекция внутрисердечно на 14-21 день после сенсибилизирующей инъекции. Доза - ориентировочно та, которая предполагается для получения основного фармакологического действия при однократном использовании.

Учет интенсивности анафилактического шока проводится в индексах по

Weigle:

++++ — шок со смертельным исходом;

+++ — шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++ — шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма).

Вычисление анафилактического индекса по Weigle проводилось по формуле:

(N×4) + (N1×3) + (N2×2) + (N3×1) + (N4×0) / N + N1 + N2 + N3 + N4,

где N — число морских свинок, у которых наступила смерть; N1 — число морских свинок, у которых развился тяжелый шок; N2 — число морских свинок, у которых развился умеренный шок; N3 — число морских свинок, у которых развился слабый шок; N4 — морские свинки, у которых шок не наступил. При гибели всех животных в группе индекс Weigle составляет 4 (++++); тяжелом шоке — 3 (+++); умеренном шоке — 2 (++); слабом шоке — 1 (+); при отсутствии анафилактоидных реакций у морских свинок индекс будет равен 0.

49

4.6.2. Активная кожная анафилаксия

На морских свинках. При изучении активной кожной анафилаксии сенсибилизация та же, что и при изучении общей анафилактической реакции

(4.6.1). На 14-21 дни на выстриженных участках спины морским свинкам вводят внутрикожно препарат в двукратных разведениях, в

концентрации, не вызывающей кожнораздражающего действия. Затем морским свинкам вводят внутривенно по 0,5 мл 1% раствора Синего Эванса.

Через 30 минут животных забивают эфиром и определяют размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата (при положительной реакция диаметр пятна не менее 6 мм). В данной серии опытов вводить препарат внутрикожно нужно микрошприцами, при правильном введении образуется так называемая лимонная корочка, если на месте введения через некоторое время проявляется кровь, то необходимо ввести препарат в другое место. Для контроля реактивности кожи обязательно вводить тому же животному на другой выстриженный участок,

по 0,05 мл растворителя (стерильный физиологический раствор). Для удобства прочтения реакции, места введения можно обводить разноцветными фломастерами. Разрешающие инъекции препарата и Синего Эванса вводят также и контрольным животным, которым в дни сенсибилизации опытных групп вводили только растворитель. У таких животных в месте внутрикожного введения препарата диаметр окрашенного пятна не должен превышать 2-3 мм. Возможно воспроизведение активной кожной анафилаксии и на мышах.

На мышах. Сенсибилизация 1 раз в 4 недели (всего 4 инъекции). Разрешающее введение - через 1 неделю после последней сенсибилизирующей инъекции в двукратных разведениях препарата внутрикожно в объеме 0,03 мл. Внутривенно введение 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Учет реакции проводят через 20-30 мин после внутрикожного введения препарата.

50