Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов

субпопуляций лимфоцитов состоят в том, что В-клетки осуществляют гуморальный иммунный ответ, а Т-лимфоциты – клеточный, а также участвуют в регуляции обеих форм иммунного ответа.

Определение уровней Т и В лимфоцитов входит в комплекс тестов, используемых для оценки иммунного статуса организма, а также иммунотропного действия лекарственных средств (ЛС) и кандидатов в ЛС.

Изменение числа Т или В лимфоцитов может быть связано с угнетением или стимуляцией их образования в центральных органах иммунной системы (тимус, костный мозг), с нарушением их дифференцировки, изменением количественного соотношения отдельных субпопуляций и т. д.

Содержание различных популяций и субпопуляций лимфоцитов в крови разных домашних животных и человека показано в таблице 1. У всех видов численность Т-лимфоцитов в крови превышает таковую В-лимфоцитов.

Таблица 1. Количество популяций лимфоцитов у различных видов животных (Tizard I.R., 2009 г.)

При поражении системы на уровне гемопоэтической клетки нарушается весь процесс кроветворения. Блокирование образования лимфоидных стволовых клеток приводит к тому, что в периферической крови уменьшается количество всех лимфоцитов и соответственно снижается уровень иммуноглобулинов (Ig) в сыворотке.

Изменение количества Т- и В - лимфоцитов в периферической крови происходит по нескольким причинам:

21

1.Не образуются или подавляется предшественники Т - клеток из лимфоидных стволовых клеток.

2.Отсутствует или низкая продукция цитокинов, обеспечивающие созревание Т – лимфоцитов (поражены эпителиальные клетки тимуса).

3.Блокировано образование одной или нескольких субпопуляций Т- лимфоцитов.

Аналогичные изменения наблюдаются и при образовании В - лимфоцитов.

Указанные сдвиги могут быть выражены в разной степени, что может проявляться как регуляторная реакция, а при глубоких нарушениях - как патологический процесс. Поэтому, контроль за популяционным составом лимфоцитов имеет большое значение в оценке иммунного статуса организма.

Разделение лимфоцитов крови представляет собой необходимый этап при определении количества и функциональной активности отдельных типов лимфоцитов. В иммунологии используется ряд методик определения иммунокомпетентных клеток крови на основе различий их физикохимических и иммунологических характеристик.

Реакция розеткообразования является наиболее простым методом для определения количества Т- и В- лимфоцитов в общем пуле иммунокомпетентных клеток. Метод основан на способности Т-лимфоцитов человека, взаимодействовать с эритроцитами барана, образовывая при этом структуры, напоминающие "розетки".

Аналогичным образом В - лимфоциты взаимодействуют с эритроцитами. Кроме клеток, образующих розетки, в периферической крови присутствуют лимфоциты, не взаимодействующие ни с одним из видов эритроцитов - это, так называемые, нулевые лимфоциты, т.е. недифференцированные клетки, количество которых в периферической крови не превышает 5-10% от общего количества всех лимфоцитов [6,11].

1.4.1. Определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК)

Разделение клеток в градиенте плотности. Принцип разделения клеток крови в градиенте плотности основан на различиях в величине их

22

плавучей плотности.

При центрифугировании в градиентном растворе клетки крови перемещаются в пробирке до тех пор, пока не достигнут области градиента, где их плавучая плотность равна плотности среды.

Для разделения лимфоидных клеток используют градиент плотности, равный 1,077 г/см3. Плавучая плотность мононуклеаров и лимфоцитов меньше, чем таковая величина используемого градиента, поэтому данные клетки располагаются над градиентом. Гранулоциты и эритроциты, имеющие большую плавучую плотность, в процессе седиментации проходят через градиентный раствор и опускаются на дно пробирки.

Вкачестве градиента плотности для разделения клеток крови используют коммерческий препарат фиколл-400 («Sigma-Aldrich» Швеция) или смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами с высокой плотностью (урографин, верографин, уротраст или изопак).

Виммунологических исследованиях используют 6,1%- или 9%-ные растворы фиколла с молекулярной массой 400 кДа (Фиколл 400). Для приготовления раствора фиколла его растворяют в теплой дистиллированной воде.

Для получения градиентных растворов с необходимой плотностью смешивают 6,1%-ный раствор фиколла с 76%-ным раствором урографина (верографина) в определенном соотношении. С помощью ареометра осторожно доводят плотность урографина 6,1%-ным раствором фиколла до необходимой величины.

Полученную смесь градиента стерилизуют в автоклаве при 0,5 бар в течение 30 минут или с помощью фильтрации на бактериальных фильтрах.

Для выделения лимфоцитов из общей суспензии форменных элементов кровь необходимо использовать сразу после взятия, но не позже 45-60 минут после взятия и освобожденную от фибрина.

Методика получения дефибринированной крови. Свежезабранную венозную кровь барана в количестве 20 мл (без антикоагулянтов и консервантов) помещают в колбу объемом 50 мл со стеклянными шариками диаметром 6–7 мм. Колбу встряхивают в течение 7–10 мин. В результате

23

этого фибрин крови переходит в небольшой тромб.

Дефибринированную кровь переносят в другой сосуд и разбавляют раствором Хенкса в соотношении 1:1.

Принцип метода Е-РОК.

Тимусзависимые Т лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые таким образом, являются специфическим маркером для их распознавания (Е-РОК: эритроцит-розеткообразующие клетки).

Приборы и оборудование:

1.Центрифуга.

2.Холодильник (бытовой).

3.Термостат.

4. Микроскоп люминесцентный.

5. Камера Горяева.

6. Счетчик клеток.

7.Автоматические пипетки или микропипетки.

8.Пробирки силиконированные или пластиковые.

9.Штатив для пробирок.

Реактивы:

1.Среда 199, раствор Хенкса.

2.Гепарин (готовят раствор из расчета 25 ЕД/мл крови).

3.Фосфатный буфер рН 7,4.

4. 0,01 % раствор акридинового оранжевого.

5.0,1 % раствор эозина, 0,1 % раствор трипанового синего на дистиллированной воде.

6.Гипак (изопак, верографин, уротраст).

7.Фиколл 400 (полисахарид с молекулярной массой 400000).

8.Эритроциты барана.

24

Ход определения:

10 мл крови венозной крови вносят в пробирку с раствором гепарина (25 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1:2; 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотности 1,077 г/мл (12 частей 9 % фиколла и 5 частей 33,9 % гипака плотности 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин [18].

В связи с тем, что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400 g. Величину центробежного ускорения G вычисляют по формуле: G= g = (1,118 x 10-5) x R x n2 (n-число оборотов в минуту, R-радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-гипака с разделяемой суспензией в см).

При центрифугировании в градиентном растворе клетки крови перемещаются в пробирке до тех пор, пока не достигнут области градиента, где их плавучая плотность равна плотности среды.

В результате центрифугирования кровь разделяется на 4 отдельные фракции: первая фракция на дне пробирки содержит эритроциты и обломки клеток крови. Вторая фракция – это раствор фиколл-урографина. Третья фракция, расположенная над градиентом, представляет собой суспензию лимфоидных клеток. Четвертая фракция образована плазмой с тромбоцитами.

После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и переносят в чистую, сухую центрифужную пробирку и разбавляют раствором Хенкса (или среда 199), содержащей 10% коммерческой телячьей сыворотки в соотношении 1:4 и центрифугируют 5 мин при 300 g, затем надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок повторно ресуспендируют в растворе Хенкса (или среда 199), содержащей 10% телячьей сыворотки, полученный осадок лимфоцитов доводят до концентрацию 2х106 клеток/мл с помощью камеры Горяева.

Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1 % раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1 % раствора

25

трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением и 1-2 капли добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3.

Приготовление эритроцитов барана. Используют эритроциты одного или смесь, полученную от нескольких животных. Эритроциты можно хранить в течение 2 недель при 4°С в растворе Олсвера (глюкоза -2,05 г, цитрат натрия - 0,8 г, хлорид натрия - 0,42 г, дистиллированная вода-100 мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10% раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3-4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5% (по объему) взвесь клеток.

Подготовка и учет реакции розеткообразования. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5% взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты:лимфоциты не должно превышать 50:1. Инкубируют смесь в термостате 37°С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и выдерживают в холодильнике 1 час при температуре 4°С. Подсчет клеток рекомендуем проводить в камере Горяева.

Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом или ацетальдегидом с последующим приготовлением мазков и подсчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать предметные стекла. Затем проводить анализ результатов реакций позже в свободное от постановки реакций время или менее загруженный день.

Однако глутаровый альдегид изменяет поверхность эритроцитов барана, вызывает неспецифическое прилипание их к клеткам крови. Более перспективен в этом плане ацетальдегид, фиксация которым эритроцитов стандартизирует определение Т лимфоцитов и делает возможным обоснованное сопоставление результатов, полученных разными лабораториями.

Для просчета клеток в камере Горяева осадок клеток осторожно ресуспендируют автоматической или пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл

26

0,01 % раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2-3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру счета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.

Поверхностные рецепторы у различных субпопуляций лимфоцитов имеют различную плотность, поэтому образуемые с ними розетки могут выглядеть по-разному. На одних лимфоцитах возможна фиксация 2-3 эритроцитов, на других - более трех. Иногда на одном лимфоците фиксируется так много эритроцитов, что их трудно сосчитать. В этом случае розетка имеет вид "Морулы".

Микроскопируют с использованием иммерсионной системы при увеличении х900 (Рис. 6).

Рисунок 6. Е-РОК Т-лимфоцитов

Впрепарате подсчитывают число свободных лимфоцитов и количество лимфоцитов, образовавших розетки. За «розетку» считают лимфоцит, к которому прикрепилось не менее 2 эритроцитов.

Вдень взятия крови необходимо проводить общий анализ крови, который дает возможность высчитывать относительные и абсолютные значения Т-лимфоцитов [6,14].

27

1.4.2.Определение В-лимфоцитов методом розеткообразования

сэритроцитами барана в системе ЕАС

Тимуснезависимые В-лимфоциты имеют на своей мембране специфические детерминанты, позволяющие дифференцировать их от Т- лимфоцитов. Таким детерминантом является поверхностный (мембранный) иммуноглобулин класса М.

В-лимфоциты способны образовывать розетки с бараньими эритроцитами, нагруженными антителами в среде комплемента.

Приборы и реактивы те же, что и для метода определения Т- лимфоцитов. Аналогично готовят и суспензию лимфоцитов.

Антисыворотку, содержащую антитела к эритроцитам, готовят путем иммунизации кролика эритроцитами барана или быка. Кролику в краевую вену уха вводят 3-5 мл 50 % суспензии эритроцитов. На 4-6 й день у него берут кровь и получают сыворотку, которая в этот период на высоте иммунного ответа и преимущественно содержит антитела класса М. Наилучший эффект получают при работе с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, которую получают высаливанием в насыщенном растворе аммиака или риванола. Антисыворотку инактивируют и определяют ее гемолитический и агглютинационный титр.

Комплемент. Источником комплемента служат свежие сыворотки мышей. Беспородных мышей декапитируют, кровь сливают в пробирку, получают сыворотку, которую затем сорбируют пулом аутологичных эритроцитов и определяют активность комплемента в гемолитической системе. Можно использовать коммерческий набор комплемента (производитель Щелковский биокомбинат, Курская биофабрика).

Сенсибилизация эритроцитов. Смешивают равные объемы 1% взвеси бараньих эритроцитов (предпочтительнее эритроциты быка) и антисыворотки к виду эритроцитов, используемых в реакции (или кроличьей гемолитической сыворотки) в субагглютинирующем разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37°С, осторожно встряхивая каждые 10 мин.

После термостатирования эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером до 10 мин при 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к осадку

28

добавляют первоначальный объем фосфатного буфера и равный объем абсорбированной мышиной сыворотки, содержащей комплемент в разведении 1 : 10. Смесь помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Вновь эритроциты трижды отмывают. При отмывании их центрифугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Готовят 0,5 % суспензию эритроцитов и просматривают под микроскопом. При наличии агглютинации эритроцитов суспензия непригодна. Готовые эритроциты, нагруженные антителами и комплементом (ЕАС), можно хранить в холодильнике (4°С) 4-5 дней.

Определение ЕАС лимфоцитов. К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов. Оптимальное соотношение эритроцитов к лимфоцитам равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 °С, после чего пробирки помещают в лед. Подсчет В-лимфоцитов проводят в камере Горяева, подсчитывают описанным выше способом.

Рисунок 7. ЕАС В-лимфоцитов

2. Оценка влияния препарата на неспецифическую резистентность организма

Одной из характерных черт иммуномодуляторов является их способность оказывать влияние на неспецифическую резистентность. Для этого целесообразно использовать в качестве объекта для исследования лабораторные модели. В качестве инфекционных агентов лучше использовать наиболее доступные для лабораторных исследований штаммы стафилококка и кишечной палочки.

29

2.1. Экспериментальные животные

Исследования проводят на следующих видах лабораторных животных: морские свинки (масса тела 250-300 г), белые крысы линии Wistar (масса тела

200-225 г), мыши линии Balb/c, C57BI/6, СВА (масса тела 18-20 г). В

некоторых случаях, в зависимости от задач эксперимента, возможно применение беспородных мышей и кроликов.

Наиболее чувствительным, в видовом отношении животным, является морская свинка. В опытах используются морские свинки-альбиносы или животные, имеющие достаточно большие участки белой кожи. Разброс в экспериментальных группах по исходной массе не должен превышать ±10%. Чувствительность самцов и самок к одному и тому же препарату может быть неодинакова, поэтому желательно проведение эксперимента на животных обоих полов. Опыты проводят на молодых, здоровых и половозрелых животных.

Животные должны пройти карантин не менее 10-14 дней. В целях стандартизации перед опытом животных не кормят в течение суток. Животные должны получать стандартную диету, представленную в виде гранулированного корма (оптимальный вариант) или набора натуральных кормов. Число животных в каждой группе должно быть не менее 5 голов, чтобы оценить характер, частоту и степень проявления аллергизирующих свойств и провести статистическую обработку экспериментальных данных. Вместе с тем, при оценке сенсибилизирующего действия необходимо проводить описание индивидуальных реакций, даже если они статистически недостоверны.

2.2. Методы введения препаратов (антигенов) лабораторным животным

Скарификация. Скальпелем делают небольшие надрезы кожи (насечки) после чего в них втирают жесткой щеткой исследуемый материал или бактериальную культуру. Шерсть на месте втирания предварительно выстригают и дезинфицируют.

Внутрикожный способ. При этом способе применяют тонкие острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают, вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы

30