Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов

цвет. Количество сегментов у сегментоядерного нейтрофила в норме чаще колеблется от 2 до 5 (Рис. 1б). Нейтрофилы с большим количеством сегментов (8–12 и более), так называемые полисегментированные, встречаются при патологии.

Нейтрофильные лейкоциты обладают способностью мигрировать, проходить через базальные мембраны и между клеточными элементами, направляясь к участкам воспаления, тканевого распада, где находятся вредоносные агенты. Им свойственна и фагоцитарная функция. Реакция на раздражение, инфекцию, сепсис выражается в выходе в периферическую кровь не только разных форм нейтрофилов крови, но и молодых образований (метамиелоцитов и миелоцитов).

Основная эффекторная функция нейтрофилов – это фагоцитоз. Показатели фагоцитарной активности зрелых нейтрофилов составляют 62– 92%, который они могут осуществлять только один раз, после чего погибают.

Нейтрофилы содержат гранулы двух типов. Первичные гранулы представляют собой лизосомы и содержат лизоцим, кислые гидролазы и миелопероксидазу. Вторичные гранулы называют специфическими. Помимо лизоцима они содержат лактоферрин и антибиотические белки, разрушающие клетки микроорганизмов (дефензины, сепроцидины, кателицидины, белок, способствующий повышению проницаемости клеточной стенки бактерий), участвуют в формировании и переносе антител и белковом обмене. Под влиянием хемотаксических стимулов (продукты микробов, поврежденных тканей, активированных тканевых макрофагов и нейтрофилов) эмигрирующие из кровотока нейтрофилы мигрируют в очаг воспаления. Вследствие быстрой экспрессии на клеточной мембране молекул адгезии, нейтрофилы первыми достигают очага воспаления и немедленно включаются в процессы поглощения антигенного материала и его внутриклеточного переваривания.

Значительный нейтрофильный лейкоцитоз свидетельствует о воспалительных процессах и является выражением полноценной защитной реакции организма.

Эозинофилы – округлые клетки, диаметром 12–17 мкм, содержат около 200 крупных специфических гранул, которые интенсивно

11

окрашиваются кислым красителем эозином. Цитоплазма этих лейкоцитов окрашена в слабо-голубой цвет, но плохо заметна из-за обильной желтокрасной зернистости. Ядро рыхлое, широкое, состоит из 2–3 сегментов, окрашено в фиолетовый цвет (Рис. 2).

Эозинофилы составляют 1–4 % всех лейкоцитов. Это – специализированная популяция лейкоцитов, способных поражать крупные внеклеточные паразиты, например, шистосомы, которые не поддаются фагоцитозу.

Дифференцировочный ряд этих клеток включает юные, палочкоядерные и сегментоядерные эозинофильные клетки отличаются морфологически хорошо идентифицируемыми удлиненными вторичными (специфическими) гранулами, включающими главный щелочной белок MBP (Major Basic Protein), гидролитические ферменты, миелопероксидазу. Первичные (неспецифические) гранулы содержат ферменты, разрушающие гистамин (гистаминаза), анафилатоксин (арилсульфатаза), кислая фосфатаза и другие молекулы. Матрикс клетки также содержит ряд протеолитических ферментов. Эозинофилы содержатся в крови в небольших количествах, от 0,5 до 2‒5% от общего числа лейкоцитов. К тканям, богатые эозинофилами относятся слизистые бронхов, желудочно-кишечного тракта, влагалища, матки. При отдельных паразитарных заболеваниях, гельминтозах, аллергиях численность эозинофилов в крови возрастает. Продолжительность жизни эозинофилов в крови колеблется от 30 мин до 7‒12 ч, в тканях — 8‒12 сут.

12

Эозинофилы способны обезвреживать токсины, фагоцитируют гранулы гистамина и тормозят его выброс базофилами и тучными клетками. Эозинофилы последними из миелоцитов мигрируют в воспалительный очаг и способствуют его ликвидации, активно участвуют в противопаразитарной защите — секретируют при встрече с паразитом катионные белки, ферменты и биооксиданты, разрушающие защитные структуры гельминтов и мицелий грибков.

Количество эозинофилов увеличивается при иммунизации, воспалительных и аллергических реакциях, аутоиммунных заболеваниях.

Базофилы - это лейкоциты, гранулы которых окрашиваются основными красителями. Форма клетки округлая или округло-овальная, диаметр клетки – 8–12 мкм. Цитоплазма окрашена в слабо-розовый цвет (более интенсивный, чем у нейтрофилов) с крупными гранулами темнофиолетового цвета. Ядро округлое или неясной структуры с 2–3 лопастями, окрашено в фиолетово-розовый цвет (Рис. 3).

Рисунок 3. Базофилы (ув х1000)

Базофилы представляют собой малочисленную популяцию клеток крови — 0,5–1% от общего количества лейкоцитов, продолжительность их жизни в тканях несколько суток, в крови — 4–8 ч. Базофилы, как и другие клетки гранулоцитарного ряда, содержат первичные (неспецифические) гранулы, богатые гидролитическими ферментами, и вторичные гранулы (специфические), содержащие гистамин, гепарин, анафилаксин, факторы хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов. При взаимодействии аллергена с

13

продуцируемым под его влиянием IgE и связывании образованного комплекса аллерген-IgEcFcεRI происходит дегрануляция базофилов с высвобождением как предсуществующих медиаторов, так и образованных в результате активации клетки — лейкотриены, простагландин D2, тромбоксан А2, ФАТ, базофильный калликреин анафилаксии и др. В результате этого формируется комплекс защитных реакций, обусловленных сокращением гладкой мускулатуры, бронхоспазмом, расширением сосудов и повышением сосудистой проницаемости, привлечением в зону реакции других типов клеток — мононуклеарных лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, стимуляцией агрегации тромбоцитов и др.

Среди агранулоцитов существует два вида лейкоцитов. Более многочисленные и мелкие называются лимфоцитами, так как они обнаруживаются не только в крови, но и в лимфе, и более крупные и не столь многочисленные – моноциты.

Лимфоциты – округлые клетки, диаметр – 5–15 мкм. Лимфоциты представляют собой часть популяции клеток, с крупным, окрашенным в темно-фиолетовый цвет ядром, и узким ободком ярко-голубой или синей цитоплазмы (Рис. 4).

Рисунок 4. Лимфоциты (ув х1000)

Другая часть клеток с более бледным ядром, часто бобовидной формы, и широким ободком серовато-синей цитоплазмы с единичными азуровыми включениями.

Основной функцией лимфоцитов является участие в иммунных реакциях. Однако популяция лимфоцитов гетерогенна по характеристике

14

поверхностных рецепторов и роли в реакциях иммунитета. Среди лимфоцитов различают три основных функциональных класса: B- лимфоциты, T-лимфоциты и нулевые лимфоциты. B-лимфоциты впервые были обнаружены в специальном органе у птиц – фабрициевой сумке, (бурсе, bursa Fabricius), поэтому и получили соответствующее название. Они образуются в костном мозге.

В-лимфоциты составляют около 30 % циркулирующих лимфоцитов. Их главная функция — участие в выработке антител, т.е. обеспечение гуморального иммунитета. Плазмолемма В-лимфоцитов содержит множество иммуноглобулиновых рецепторов. При действии антигенов В-лимфоциты способны к пролиферации и дифференцировке в плазмоциты — клетки, способные синтезировать и секретировать защитные белки – антитела, или иммуноглобулины, которые поступают в кровь, обеспечивая гуморальный иммунитет.

Т-лимфоциты, или тимусзависимые лимфоциты, образуются из стволовых клеток костного мозга, а созревают в тимусе (вилочковой железе), что и обусловило их название. Они преобладают в популяции лимфоцитов, составляя около 70 % циркулирующих лимфоцитов. Для Т-клеток, в отличие от В-лимфоцитов, характерен низкий уровень поверхностных иммуноглобулиновых рецепторов в плазмолемме. Но Т-клетки имеют специфические рецепторы, способные распознавать и связывать антигены, участвовать в иммунных реакциях. Основными функциями Т-лимфоцитов являются обеспечение реакций клеточного иммунитета и регуляция гуморального иммунитета (т.е. стимуляция или подавление дифференцировки В-лимфоцитов). Т-лимфоциты способны к выработке сигнальных веществ - цитокинов, которые регулируют деятельность В- лимфоцитов и других клеток в иммунных реакциях. Среди Т-лимфоцитов выявлено несколько функциональных групп: Т-хелперы, Т-супрессоры, Т- киллеры.

Нулевые лимфоциты не имеют поверхностных маркеров на плазмолемме, характерных для В- и Т-лимфоцитов. Их расценивают как резервную популяцию недифференцированных лимфоцитов.

Продолжительность жизни лимфоцитов варьирует от нескольких

15

недель до нескольких лет. Т-лимфоциты являются «долгоживущими» (месяцы и годы) клетками, а В-лимфоциты относятся к «короткоживущим» (недели и месяцы). Для Т-лимфоцитов характерно явление рециркуляции, т.е. выход из крови в ткани и возвращение по лимфатическим путям снова в кровь. Таким образом, они осуществляют иммунологический надзор за состоянием всех органов и клеток, на внедрение чужеродных агентов.

Моноциты – наиболее крупные клетки крови (12–20 мкм). У моноцита ядро светло-фиолетового или сиреневого цвета, в виде боба, бабочки или гриба, занимает большую часть клетки (Рис. 5).

Рисунок 5. Моноциты (ув х1000)

Протоплазма синевато-дымчатая, иногда содержащая в большом количестве мелкую азурофильную зернистость. Моноциты в норме составляют 2–8 % от общего количества лейкоцитов.

Количественный состав отдельных видов лейкоцитов периферической крови характеризует функциональное состояние системы неспецифической защиты организма. Изменения в нем могут быть обусловлены заболеваниями системы крови и реакцией кроветворного аппарата на развитие самых разнообразных патологических состояний [10].

1.3. Определение субпопуляций лейкоцитов (выведение лейкоцитарной формулы крови животных (лейкограмма))

Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.

Подготовка стекол.

16

Реактивы:

1.Моющий раствор - 2 % мыльный раствор (или стирального порошка): 20 г растворить в 975 мл воды и добавить 20 мл пергидроля.

2.Смесь Никифорова (обезжиривающий раствор): равные части этилового спирта 96% и диэтилового эфира.

Подготовки стекол для мазков. Стекла (новые и бывшие в употреблении) помещают в эмалированную или стеклянную посуду (использование алюминиевой или жестяной посуды не рекомендуют, так как стекла мутнеют) с моющим раствором на 8–10 ч. Кипятят в указанном растворе 5–10 мин. Промывают в проточной воде. Насухо вытирают и помешают для обезжиривания в смесь Никифорова на 30-60 мин, после насухо вытирают чистой вафельной тканью или марлей и хранят в широкогорлой стеклянной банке с притертой пробкой. Чистые стекла рекомендуется брать пинцетом или за края (соприкосновение пальцев с поверхностью стекла оставляет жирные следы).

Техника приготовления мазков:

Необходимые материалы и оборудование: световой микроскоп, предметные стекла, кровь животных, краска Романовского–Гимза, этиловый спирт.

На середину хорошо вымытого и обезжиренного предметного стекла без царапин наносят каплю исследуемой крови величиной с «просяное зерно». Затем делают мазок при помощи шлифованного стекла или покровного стекла более узкого, чем основное предметное стекло. При этом узкое стекло прикладывают к основному стеклу под углом 45 градусов.

Дают капле крови растечься по краю шлифа и быстро продвигают его к противоположному концу стекла. Мазки крови должны быть равномерными и тонкими и не доходить до края предметного стекла. Мазки крови сушат на воздухе, а затем фиксируют в закрытой кювете химически чистым метиловым спиртом в течение 5 минут или 20 мин в этаноле. Зафиксированные мазки окрашивают в течение 20 минут свежеприготовленным раствором красителя по Романовскому-Гимзе (2–3 капли основного раствора красителя на 1 мл воды).

17

В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. После окраски препараты крови промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе и исследуют под микроскопом (масляная или глицериновая иммерсия, объектив х90 окуляр х7–10).

Плохое приготовление мазка приводит к неравномерному распределению лейкоцитов и дает при подсчете неправильное соотношение их отдельных популяций. В толстом мазке форменные элементы крови трудно различимы.

Лейкограмму определяют посредством дифференциального подсчета лейкоцитов на мазках. Начинают подсчет клеток крови с середины окрашенного мазка, передвигая предметное стекло зигзагообразно от центра к краю по всей поверхности мазка (зубчатая линия Меандра).

Более крупные по величине клетки крови располагаются по краям препарата. Считают подряд все встречающиеся в поле зрения форменные элементы (всего 200 клеток), распределяя их в отдельные популяции с учетом величины клеток, формы и окраски ядра и цитоплазмы. Определяют процентное и абсолютное содержание клеток различных популяций в исследуемом образце.

При подсчѐте могут использоваться 2 способа:

Метод Шиллинга. Заключается в определении числа лейкоцитов в четырѐх участках мазка.

Метод Филипченко. В этом случае мазок мысленно делят на 3 части и ведут подсчѐт по прямой поперечной линии от одного края к другому.

При оценке иммунореактивности организма для большей информативности необходимо определение не только абсолютного содержания лейкоцитов, но и интегральные показатели, представляющие соотношения различных их субпопуляций (лейкоцитарные индексы), являющиеся чувствительными индикаторами иммунологической реактивности организма.

18

Интегральные показатели оценки иммунологической реактивности организма (лейкоцитарные индексы):

1.Индекс Гаркави (ИГ = лимфоциты / сегментоядерные нейтрофилы).

2.Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ в модификации Б.А. Рейса)

(ЛИИ = (миелоциты + метамицелоциты (юные) + палочкоядерные нейтрофилы + сегментоядерные нейтрофилы) / (моноциты + лимфоциты

+эозинофилы)).

3.Ядерный индекс степени эндотоксикоза (ЯИСЭ = (моноциты +

метамиелоциты + палочкоядерные нейтрофилы) / сегментоядерные

нейтрофилы).

4.Ядерный индекс сдвига (ЯИС = (миелоциты + метамиелоциты +

палочкоядерные нейтрофилы) / сегментоядерные нейтрофилы).

5.Индекс аллергизации (ИА = (лимфоциты + 10 × (эозинофилы + 1)) /

(палочкоядерные нейтрофилы + сегментоядерные нейтрофилы + моноциты

+базофилы)).

6.Индекс иммунореактивности (ИИР = (лимфоциты + эозинофилы) /

моноциты).

7.Индекс соотношения нейтрофилов и моноцитов (ИСНМ = миелоциты

+метамицелоциты + палочкоядерные нейтрофилы + сегментоядерные нейтрофилы / моноциты).

8.Индекс соотношения лимфоцитов и моноцитов (ИСЛМ = лимфоциты /

моноциты).

9.Индекс соотношения лимфоцитов и эозинофилов (ИСЛЭ = лимфоциты

/ эозинофилы (при наличии эозинофилов).

10. Индекс соотношения эозинофилов и лимфоцитов (ИСЭЛ = эозинофилы /

лимфоциты), который не зависит от наличия или отсутствия эозинофилов. 11. Нейтрофильно-лимфоцитарный коэффициент (НЛК = (миелоциты +

19

метамиелоциты + палочкоядерные нейтрофилы + сегментоядерные

нейтрофилы) / лимфоциты).

12. Индекс сдвига лейкоцитов (ИСЛ = (эозинофилы + базофилы +

миелоциты + метамиелоциты + палочкоядерные + сегментоядерные) /

(моноциты + лимфоциты)).

13. Лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс (ЛГИ = лимфоциты × 10 /

(эозинофилы + базофилы + миелоциты + метамиелоциты +

способности приспосабливаться к воздействию токсических факторов и

иммунологических реакций в ответ на воздействие антигенных веществ и при поражении.

При подсчете количества в настоящее время применяется гематологический автоматический анализатор, но их применение в ветеринарной практике ограничено в связи с многообразием видов животных и особенностей морфологий клеток крови у отдельных видов. Микроскопическая оценка мазка позволяет выявление отклонений с описанием четкой морфологии видимых клеток лейкограммы. Автоматический подсчет также не позволяет различать нейтрофилы по сегментоядерным, палочкоядерным, юным и миелоцитам [1,12].

1.4. Определение Т- и В-лимфоцитов методом розеткообразования

При весьма сходной морфологии по происхождению и функциональной направленности лимфоциты делятся на две популяции, относящиеся к Т- или В-зависимой системе. В крови отдельных видов животных на долю Т-клеток приходится более 80% лимфоцитов. В- лимфоциты в среднем составляют 15%.

Две основные группы Т- и В-лимфоцитов морфологически мало отличаются друг от друга. Основные функциональные отличия этих

20