Методы определения иммуномодулирующей (иммунотропной) активности фармацевтических препаратов

должен быть виден. При введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.

Подкожный способ. Кожу в месте введения материала берут у ее основания. Иглу шприца вкалывают снизу образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи опускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей— область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно превышать 30 мл для кроликов, 15 мл — для морских свинок, 10 мл — для крыс и 1 мл — для мышей.

Внутримышечный способ. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов, морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Вводят иглу почти под прямым углом вглубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутримышечного введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок — 5 мл, для крыс — 3 мл, для мышей — 0,5 мл.

Внутрибрюшинный способ. Держат животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи длиной 2—3 мм и через ее вводят притуплѐнную иглу, держа шприц перпендикулярно к брюшной стенке. Внутрибрюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10 мл — морским свинкам, до 5 мл — крысам, до 2 мл — мышам.

31

Внутривенный способ на кроликах. Кроликам вводят антиген в краевую вену уха. Вдоль наружного края уха выщипывают шерсть, затем это место слегка пощелкивают кончиками пальцев, чтобы вызвать гиперемию сосудов, и протирают ватой, смоченной в 70% спирте. Чтобы удостовериться, правильно ли введена игла, вводят сначала небольшое количество материала. При нахождении иглы в полости вены материал вводится свободно, в противном же случае жидкость из шприца вытекает с трудом, а на ухе в месте введения образуется вздутие. Если игла не попала в вену, ее вынимают и вводят повторно в другое место, ближе к основанию уха. По окончании введения нижний участок вены слегка придавливают, а к месту укола прикладывают кусочек стерильной ваты, смоченной спиртом или спиртовым раствором йода, после чего из вены извлекают иглу. Внутривенно кроликам можно вводить до 20 мл жидкости.

Внутривенное крысам и мышам. Крыс и мышей заражают в боковую вену хвоста. Непосредственно перед введением материала хвост животного, чтобы вызвать гиперемию сосудов, погружают в сосуд с водой, подогретой до 50°С, смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды заметно набухают, корень хвоста сдавливают пальцами. Взрослым белым крысам допускается вводить до 6 мл жидкости, мышам — до 0,5 мл.

Введение через пищеварительный тракт. Заразить животное через рот можно двумя способами. Материал, предназначенный для заражения, примешивают к корму или питью животного. Такой способ является наиболее простым и естественным, однако в лабораторной практике применение его ограничено, поскольку количество материала, попадающее в организм животного, не подлежит точному учету. Поэтому значительно чаще материал, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы в пищевод животного.

Интрацеребральное введение. Применяется чаще у кроликов, крыс и мышей. Трепанируют область между надбровными буграми и черепным гребнем. Трепаном выпиливают диск, производят введение, закрывают тампоном и заливают коллодием. Доза вводимого материала — 0,2-0,3 мл. При отсутствии инструментов для трепанации можно произвести введение в

32

мозг путем прокола черепа через кожу, иглой шприца, несколько сбоку от средней линии в области затылочного бугра.

2.3. Оценка влияния препарата на гуморальный иммунный ответ

Оценку влияния препарата на гуморальный иммунный ответ изучают путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) и титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей высокоотвечающей (СВА) и низкоотовечающей (C57/BL) линий. Для иммунизации животных следует использовать минимальные дозы (5х106) антигена.

Число АОК определяют с помощью метода локального гемолиза по Ерnе и Нордину [19]. Для этого клетки селезенки иммунизированных животных совместно с эритроцитами барана и комплементом помещают в агаровый (агарозный) гель. Клетки в условиях in vitro продолжают синтезировать антитела, которые лизируют эритроциты. Вокруг этих клеток образуются видимые макроскопические зоны гемолиза. Подсчитывая эти зоны, можно определить какое число АОК приходится на 100 ядросодержащих клеток и на всю селезенку.

При постановке опыта мышей внутрибрюшинно иммунизируют эритроцитами барана в дозе 5х106. При определении числа IgM-AOK на 4-е сутки (пик развития lgM-ответа) животных забивают, изолируют селезенку и с помощью стеклянного гомогенизатора готовят клеточную суспензию, фильтруют ее через двойной капроновый фильтр и после счета в камере Горяева доводят концентрацию спленоцитов до 1х107 клеток на 1 мл.

Готовят смесь, состоящую из 0,7% агара Difko на среде Хэнкса клеток селезенки и эритроцитов барана. Для этого к 0,5 мл расплавленного и помещенного в водяную баню при 45оС агара добавляют 50 мкл суспензии спленоцитов и 10 мкл осадка эритроцитов, трижды отмытых в физиологическом растворе.

Смесь выливают в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и быстрыми круговыми движениями равномерно распределяют агаровую смесь по дну чашки. После застывания агара чашки помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С.

33

После инкубации к чашкам добавляют комплемент 0,5 мл сыворотки морской свинки в разведении 1:10, и снова инкубируют 1 час в термостате при той же температуре. Учет результатов опыта ведется невооруженным глазом. На красном фоне подсчитывают число зон гемолиза (просветления). Каждая зона соответствует одной IgM АОК.

Для определения числа IgG АОК животных забивают на 7-й день пика развития lgG-ответа. Опыт ведут как при определении IgM АОК после подсчета числа этих клеток в чашки Петри вносят 0,5 мл кроличьей антисыворотки против мышиного IgG в соответствующем разведении. Далее инкубируют 1 час в термостате при 37оС, добавляют комплемент и после инкубации подсчитывают число вновь появившихся зон гемолиза, каждая из которых соответствует одной IgG АОК.

Для определения титра антител используют реакцию гемагглютинации с эритроцитами барана. Она основана на способности антител содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. Кровь для получения сыворотки берут на 7-10 день после иммунизации мышеи эритроцитами барана (максимум накопления антител в крови) в вышеуказанной дозе путем декапитации. В 96 луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл начиная с разведения 1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора.

Ко всем лункам добавляют 0,5 мл 1% суспензии эритроцитов барана. Учет реакции ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 часов при 37°С. При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки планшета в виде зонтика при отрицательном - в виде пуговки. За титр принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть отрицательной.

При оценке действия препарата на гуморальный иммунный ответ изучают его влияния на индуктивную и продуктивную фазу этого ответа. В первом случае различные дозы препарата вводят одновременно с антигеном; во втором случае - на 4 или 7 сутки после иммунизации при изучении IgM и IgG ответа соответственно.

34

2.4. Оценка влияния препарата на клеточный иммунный ответ

Для оценки влияния препарата на клеточный иммунный ответ используют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) характеризующуюся двумя важными чертами информативностью и простотой исполнения. При постановке ГЗТ антиген вводят двукратно для сенсибилизации и для разрешения.

Сенсибилизация корпускулярными или растворимыми белковыми антигенами вызывает образование антиген специфических Т-лимфоцитов. При повторном введении антигена эти Т-лимфоциты специфически взаимодействуют с ним и выделяют ряд провоспалительных цитокинов. Если разрешающая доза антигена вводится подкожно или внутрикожно, то на месте инъекции развивается воспалительная реакция, интенсивность которой легко измерить. Классическим примером ГЗТ является туберкулиновая проба к КРС, когда на месте введения туберкулина проявляется специфическая реакция в виде припухлости.

При постановке ГЗТ для сенсибилизации мышам подкожно вводят 1х107 эритроцитов барана в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена 1x106 эритроцитов барана в объеме 20 мкл вводят на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей. В контралатеральную лапу в качестве контроля вводят физиологический раствор в таком же объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляют через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Для этого мышей забивают; сразу после этого обе лапки отрезают на уровне голеностопного сустава и взвешивают на торсионных весах. Определяют индекс воспаления (ИВ) по разнице массы опытной (О) и контрольной (К) лап:

ИВ= О-К / К х 100

Оценку влияния препарата целесообразно осуществлять как на стадию сенсибилизации, так и разрешения. С этой целью различные дозы препарата вводят одновременно с сенсибилизирующей и разрешающей дозами антигена. При этом, препарат оказывает влияние на различные стадии клеточного иммунного ответа: в первом случае на процесс образования клона антиген специфических Т-лимфоцитов: во втором случае на способность

35

провоспалительные цитокины.

2.5. Оценка влияния препарата на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов

Оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов с помощью реакции бласттрансформации в известной степени является интегральным методом определения их функциональной активности. Этот метод основан на способности некоторых лектинов вызывать поликлональную активацию и пролиферацию лимфоцитов, которая оценивается радиометрически по интенсивности включения в клетки 3Н-тимидина.

Как правило для активации Т-лимфоцитов используют фитогемагглютинин (ФГА) или конканавалин А (Кон А); для активации В- лимфоцитов - митоген лаконоса (МЛ) или Staphylococcus aureus.

В реакции бласттрансформации используют взвесь лимфоцитов полученных по выше описанной методике (раздел 2.4 Оценка влияния препарата на клеточный иммунный ответ).

При постановке реакции бласттрансформации лимфоциты доводят до концентрации 2 млн/мл полной ростовой средой состоящей из среды RPMI 1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки 10мМ, 2 мМ L-глютамина и 40 мкг/мл гентамицина.

Реакцию ставят в объеме 150 мкл в 96 луночных плоскодонных планшетах. В опытные лунки вносят 50 мкл лимфоцитов с указанной выше концентрацией клеток (2 млн клеток/мл) и 50 мкл Т- или В- митогена в соответствующей дозе (дозу митогена следует определить в предварительных экспериментах и для оценки действия препарата она должна быть субоптимальной) и 50 мкл ростовой средой (индуцированная бласттрансформация) [6,14].

В контрольные лунки вносят 50 мкл клеток и 100 мкл ростовой средой (спонтанная бласттрансформация). Планшеты направляют на 72 часа при температуре 37°С в СО2 инкубатор, содержащей 5% СО2. За 6 часов до окончания инкубации в опытные и контрольные лунки добавляют 1μCi 3Н- тимидина.

36

После окончания инкубации с помощью специального прибора для сбора клеток харвестера лимфоциты из лунок планшета переносят на стекловолокнистый фильтр и тщательно промывают дистиллированной водой. Вся радиоактивность связанная с макромолекулярными структурами клетки, остается на фильтре. Фильтры помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и измеряют радиоактивность на b-счетчике. Каждую пробу ставят в трех лунках и результаты по определению радиоактивности усредняют. Оценку результатов опыта определяют по двум показателям: числу импульсов в мин и индексу стимуляции (ИС). Последний определяют по формуле:

ИС =О/К

где,

О - радиоктивность в лунках с митогеном,

К - радиоактивность в лунках без митогена.

Изучение препарата на пролиферативный ответ Т- и В лимфоцитов целесообразно проводить на моделях как индуцированной, так и спонтанной бласттрансформации.

В первом случае в опыте смешивают 50 мкл лимфоцитов, 50 мкл митогена в субоптимальной концентрации и 50 мкл препарата в соответствующем разведении; в контроле - 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл митогена и 50 мкл полной ростовой среды (ПРС).

Во втором случае в опыте смешивают 50 мкл лимфоцитов, 50 мкл препарата в соответствующем разведении (2 млн клеток/мл) и 50 мкл полной ростовой среды (ПРС); в контроле - 50 мкл лимфоцитов и 100 мкл полной ростовой средой. По иммуностимуляции оценивают влияние препарата на спонтанную и индуцированную пролиферацию лимфоцитов.

2.6.Оценка влияния препарата на синтез интерлейкина-2

идругих цитокинов

Интерлейкин-2 (ИЛ-2) является одним из центральных цитокинов иммунной системы, играющим исключительно важную роль в иммунорегуляторных процессах. Он синтезируется преимущественно Th1лимфоцитами с фенотипом CD3+CD4+, хотя некоторые клоны CD3+CD8+ Т-

37

лимфоцитов также обладают способностью продуцировать этот цитокин.

Одним из главных функциональных свойств ИЛ-2 является стимуляция пролиферации лимфоидных клеток. Это свойство ИЛ-2 используется для оценки его функциональной активности in vitro. Используются для этих целей два биологических метода:

1.Определение ИЛ-2 с помощью ИЛ-2-зависимой Т-клеточной линией

CTLL;

2.Определение ИЛ-2 с помощью бластов, путем стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином (ФГА) или конканавалин - А (Кон А).

Общим этапом у этих методов является получение материала, являющегося источником ИЛ-2. В качестве этого материала используют супернатанты культур ИЛ-2-зависимой Т-лимфоцитов линии CTLL, полученные на первые сутки их культивирования in vitro. Клетки выращивают в 24-луночных или 96-луночных круглодонных планшетах при 37оC в атмосфере с 5% CO2 в среде ПРС (полной ростовой среды) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и 50 мкг/мл гентамицина. Клетки засевают в количестве 4х103 на лунку. Результаты исследований учитывают по выживании Т-лимфоцитов культивируемых в присутствии препарата и от клеток культивируемых только в полной ростовой среде (ПРС).

При определении ИЛ-2 с помощью бластов, последние получают через 72 часа после стимуляции лимфоцитов с помощью ФГА используя для этих целей оптимальную дозу митогена. Клетки трижды отмывают в ПРС, подсчитывают их количество в камере Горяева, и доводят их до концентрации 2x106 полной ростовой средой (ПРС).

В опытные лунки 96 луночного круглодонного планшета вносят по 100 мкл бластов и 100 мкл исследуемых супернатантов; в контрольные лунки 100 мкл бластов и 100 мкл полной ростовой среды (ПРС).

Как в первом, так и во втором опыте планшеты помещают на 24 часа при температуре 370С в СО2-инкубатор содержащий 5% СО2. За 6 часов до окончания инкубации в опытные и контрольные лунки добавляют 1μCi 3Н- тимидина.

38

Учитывают интенсивность включения метки в лимфоциты по числу имп/мин. Оценивают способность исследуемого препарата усиливать и индуцировать (лимфоциты стимулированные только препаратом) синтез ИЛ-2. Полученные результаты сравнивают с данными исследования супернатантов лимфоцитов, культивируемых без препарата.

Оценка результатов. ИЛ-2 является одним из важнейших факторов, обеспечивающих нормальное развитие иммунного ответа, поэтому нарушение его продукции свидетельствует о серьезных изменениях в иммунологическом статусе организма. Синтез ИЛ-2 осуществляется Т- клетками, имеющими хелперный фенотип, т.е. Th1 хелперами I типа.

Ингибиция продукции ИЛ-2 Т-хелперами указывает в первую очередь на нарушение его синтеза в этой субпопуляции лимфоцитов. Однако следует учитывать тот факт, что активация Т-хелперов зависит от вспомогательных клеток (макрофагов, дендритических клеток).

2.7. Оценка влияния препарата на функциональную активность естественных киллеров

Естественные киллеры (ЕК) представляют собой большие гранулярные лимфоциты с фенотипом CD3+CD16+CD56+. Они играют важную роль в защите организма от различных внутриклеточных микроорганизмов и опухолевых клеток. ЕК распознают и убивают клетки мишени без предварительной их сенсибилизации. Функциональную активность ЕК определяют в цитотоксической реакции, по их способности лизировать эти клетки используя, как правило, радиометрический метод.

Для этого на 2 день после пересева клетки линии К-562 в концентрации 10мкМ/мл инкубируют в течение 1 часа при 37°С с 3Н-уридином в дозе 3 μCi на 1 мл клеточной суспензии и после инкубации трехкратно отмывают от метки в большом избытке среды 199.

Цитотоксическую реакцию ставят в объеме 200 мкл в круглодонных 96луночных планшетах. Для этого 100 мкл меченных клеток-мишеней и 100 мкл мононуклеаров (клетки-эффекторы) периферической крови (мыши, крысы…) смешивают в соотношении 1:50, 1:25 и 1:10 в триплетах на каждое разведение. Для определения спонтанного выхода метки к клеткам-мишеням добавляют равное количество полной ростовой среды (ПРС).

39

Для определения максимального выхода метки к клеткам-мишеням добавляют равный объем тритона Х-100. Для определения влияния препарата на функциональную активность ЕК к смеси клеток эффекторов и клеток-мишеней добавляют исследуемую дозу препарата взятую в минимальном объеме (10-20 мкл). Планшеты отправляют на 16-24 часа в СО2 инкубатор при 37°С.

Далее содержимое клеток переносят, с помощью харвестера на стекловолокнистые фильтры, промывают, сушат, помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и определяют радиоактивность на b-счетчике. Определяют индекс цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

ИЦ= 1 - (А- В) / (С - В) х 100,

где

А - радиоактивность клеток-мишеней в присутствии клетокэффекторов;

В - радиоактивность, оставшаяся после обработки клеток-мишеней тритоном Х-100 (максимальный выход);

С - радиоактивность клеток мишеней в отсутствии клетокэффекторов.

Оценку влияния препарата на функциональную активность естественных киллеров или NK-клеток (Natural killer cells) определяют путем сопоставления ИЦ в культурах лимфоцитов, инкубированных в присутствии препарата и без него.

Выбор из числа приведенных методов тех, которые необходимы для изучения предполагаемой иммунотропной активности конкретного препарата, определяется его физико-химическими, фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. Этим же, в конечном итоге определяется выбор используемых концентраций изучаемого препарата, режима и способов его введения в организм или испытания в условиях in vitro.

Главным является идентификация того звена иммунитета, на который действует данный препарат. Эффект влияния препарата на тот или иной параметр иммунитета может считаться доказанным, если

40