Инновационное развитие науки возможности, проблемы, перспективы. Часть IV. Монография

Инновационное развитие науки: возможности, проблемы, перспективы

Часть IV

МОНОГРАФИЯ

Научный редактор

доктор педагогических наук, профессор С.П. Акутина

Издание включено в РИНЦ

Москва 2020

1

УДК 001 ББК 72я43

И66

Рецензенты:

доктор педагогических наук, профессор ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный

университет им. Н. И. Лобачевского» Арзамасский филиал

Акутина С.П.

Доктор медицинских наук, профессор, зав.кафедрой профилактической медицины ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России

Позднякова М.А.

кандидат юридических наук, доцент, зав. кафедрой уголовного права, процесса и криминалистики филиала ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»

Сирик М.С.

И66 Инновационное развитие науки: возможности, проблемы, перспек-

тивы. Монография. Часть IV / Научный ред. д.пед.н., проф. С.П. Акутина.

– М.: Издательство «Перо», 2020. – 0,9 Мб. [Электронное издание].

ISBN 978-5-00150-190-9 (Общ.)

ISBN 978-5-00171-099-8 (Ч.4.)

В коллективной монографии представлены теоретические и практические материалы, посвященные актуальным вопросам современной науки.

Работы, поступающие в редакцию, рецензируются. За достоверность сведений, изложенных в работах, ответственность несут авторы публикаций. Мнение редакционной коллегии может не совпадать с мнением авторов.

Издание охраняется Законом РФ об авторском праве. Любое воспроизведение материалов, размещенных в сборнике, как на бумажном носителе, так и в виде ксерокопирования, сканирования, записи в память ЭВМ и размещение в Интернете, без согласия издателя, запрещается.

УДК 001 ББК 72я43

ISBN 978-5-00150-190-9 (Общ.)

ISBN 978-5-00171-099-8 (Ч.4.)

Отпечатано с готового оригинал-макета.

© Авторы статей, 2020

2

РАЗДЕЛ 1. ХИМИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЦИКЛ

УДК 612.111: 577.1(07)

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АМИКАЦИНА И ЦЕФТАЗИДИМА С ГЕМОГЛОБИНОМ ЧЕЛОВЕКА

Баева Е. С.

Воронежский государственный медицинский университет им. Н. Н. Бурденко, г. Воронеж

Ключевыеслова: антибиотики, амикацин, цефтазидим, гемоглобин.

Открытие антимикробных средств послужило новой вехой в терапии воспалительныхзаболеваний. Успешноеиспользованиеантибиотиковвлечениипотенциально опасных для жизни инфекций стало возможным благодаря их быстрому антимикробному действию и способности к иммуногенной коррекции вос- палительногопроцесса[1-6]. Однаковопросрациональнойантибиотикотерапии, особенно в педиатрии, остается актуальной и сложной задачей ввиду наличия у многих антимикробных препаратов побочных и неантибактериальных эффектов различного рода [6-16]. Повышенная восприимчивость детей к бактериальным и вирусным инфекциям объясняется их иммунологической незащищенностью, несовершенством барьерных функций кожи и слизистых в первые месяцы жизни [12; 17; 18]. Учитывая тот факт, что клиническая эффективность антибиотиков определяется распределением в органах и тканях, степенью связывания белками

испособностью проникать через физиологические барьеры организма, назначение антибактериальной терапии проводят с учетом возраста ребенка, что позволяет принять во внимание особенности их абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции [9; 11; 14; 16; 19-21].

Одними из наиболее эффективных химиотерапевтических средств современной медицины являются цефалоспорины и аминогликозиды, которые активно применяются для лечения внутрибольничных инфекций у детей первых месяцев жизни [7,8,17,19,22-27]. Среди представителей этих классов следует выделить цефтазидим и амикацин, которые отличаются широким спектром антибактериальногодействия. Выявлено[17], чтоданныеантибиотикивсубтерапевтических

итерапевтических концентрациях подавляют адгезию большинства штаммов, приэтомцефалоспориныпроявляют максимальнуюингибирующуюактивность. Авторами показано, что количество штаммов, ингибируемых цефалоспоринами

иаминогликозидами, увеличивалось вместе с повышением концентрации антибиотиковот субтерапевтических до терапевтических концентраций [17].Использование данных антибиотиков, однако, зачастую сопровождается проявлением нежелательных побочных эффектов, усугубляющих течение заболевания [7; 8; 10; 12]. В настоящее время при анализе патогенеза клеточных процессов особое внимание уделяется исследованию гемолитических свойств крови, а также

5

структурно – функциональным свойствам белков в норме и патологии. Анализ функциональных свойств организма в целом во многом зависит от таких показателей, как рН крови, буферная ёмкость крови и её компонентов, а также структурное состояние форменных элементов. В современной литературе приводятся сведенияобосновахизбирательностидействияамикацинаицефтазидиманабактерии, однако молекулярные механизмы их взаимодействия с соматическими клетками эукариот остаются мало изученными. По этой причине нередко применение данных препаратов не только может не достигнуть предназначенной им цели, но, главное, сопровождаться проявлением побочных эффектов.

Последние достижения в фармакологических исследованиях свидетельствуют о том, что эритроциты используются в качестве носителей аминогликозидов. Инкапсулированные в эритроциты антибиотики обладают потенциалом обеспечить эффективную терапию против внутриклеточных патогенов. Преимущества по сравнению с введением свободных антибиотиков включают более низкую системную дозу, снижение токсичности, устойчивую доставку антибиотика в более высоких концентрациях к внутриклеточному участку репликации патогена и повышенную эффективность. Амикацину свойственно длительное 48-часовое высвобождение из нагруженных эритроцитов, что предполагает потенциальное использование этих клеток в качестве медленного способа системной доставки антибиотика [28; 29]. Выявлено, что эритро- циты-носителиамикацина, полученныегипотоническимдиализомсиспользованием буфера низкой осмоляльности (90 мосм/кг), характеризуются хорошими морфологическими свойствами и длительным высвобождением антибиотика in vitro [30]. Однако в исследованиях [31, 32]показано, что указанные антибиотики, проникаявэритроцитычеловека(новорожденных), индуцируют ихслабуюгемолитическуюактивность; отмечается, чтостепеньосмотической резистентности эритроцитарных клеток определяется химической природой модификатора и временем его взаимодействия с клетками. Установленное авторами изменение осмотической резистентности эритроцитов детей уже на начальном этапе их взаимодействия с антибиотиками указывает на высокий уровень чувствительности эритроцитарных клеток к присутствию модификаторов в инкубационной среде. В работе [33] показано, что антибиотики данного класса индуцируют гемолиз эритроцитов человека в широком диапазоне концентраций (10-160 мкг/мл). Установлено, что амикацин индуцирует значительные изменения в органах ретикуло-эндотелиальной системы [30]. Полученные данные свидетельствуют о протекании реакций комплексирования антибиотиков с белковыми компонентами мембран. Ввиду того, что гемоглобин является основным белком эритроцитарных клеток, представляло интерес на модельной системе антибиотик – гемоглобин оценить степень влияния амикацина и цефтазидима на структурно-функциональное состояние гемопротеида.

Вэтойсвязирассмотримсовременныепредставленияоструктурно-функ- циональных особенностях как оксигемоглобина человека, так и исследуемых антибиотиков, а также результаты собственного исследования.

6

1.Объекты исследования

1.1.Физико-химические и функциональные свойства гемоглобина человека

Внутриклеточная структура эритроцита представлена молекулами гемо-

глобина, заключенными в регулярную решетку, которая образована липостроматином и молекулами воды. Часть молекул гемоглобина (7 %) связана с мембраной [34].

Гемоглобин (Hb) – сложный белок класса гемопротеидов, который в качестве простетической группы содержит гем, белковой – глобин. На долю гемоглобина в эритроцитах приходится более 95 % от всех белков. Гемоглобин

–это гемопротеид, который в качестве простетической группы содержит протогем. Гем представляет собой комплекс протопорфирина IX – системы из четырех пиррольных колец, связанных метиновыми мостиками с железом в центре, обладающий электронно-донорными и электронно-акцепторными свойствами [35].

Молекулярная массаHb составляет 64000 – 66000 Да; он состоит из четырех полипептидных D - и E -цепей, каждая из которых содержит свой собственный гем. В состав D-цепи входит 141 аминокислотный остаток, E-цепи

–146, из которых 65 одинаковых и 75 разных [35; 36]. Всего в молекуле гемоглобина человека содержится 574 аминокислотных остатка (Табл.1).Четыре полипептидные цепи Hb ассоциированы примерно в тетраэдрическую структуру и образуют почти сферическую молекулу. Каждая субъединица имеет три типа контактов: D1- D2, D1- E1, E1- E2. Причем, контакты D1- D2 и E1- E2 имеют небольшую энергию связи и осуществляются полярными группами, а разноименные контакты, осуществляемые гидрофобными взаимодействиями, значительно прочнее. Это обусловливает диссоциацию молекул в растворе на димеры [38; 39]. Молекула Hb в целом имеет размеры 6,4 x 5,5 х 5,0 нм. В центре молекулы расположена довольно большая полость, заполненная водой. По форме представляет вид двух прямоугольных камер размером 2.0 - 2.5 нм, поставленных друг на друга под прямым углом и открытых снизу и сверху [38].

Таблица № 1 Аминокислотный состав гемоглобина человека [37]

7

Железопорфирин вдвинут в щель винильными остатками вперед и удерживается таким образом, что атом железа располагается между двумя гистидиновымиостаткамипопятомуишестомукоординационнымположениям.

Железо в порфирине имеет 6 координационных мест, четыре из которых связаныатомомазотавплоскоститетрапиррольногокольца, адвасвободны. Все лигандированные формы гемоглобина – 6-координационные, а низкомолекулярные лиганды располагаются чаще всего в шестом координационном положении. Атом железа связан непосредственно лишь с одним гистидином, с другими связей нет, несмотря на то, что расстояние достаточно для образования водородных связей [38; 39]. Гистидиновый остаток, не взаимодействующий с гемовым железом, образует гидрофобную полость, соединенную узкой полостью с внешней средой и служащую местом адсорбции О2[39]. Основной функцией атома железа

вмолекуле гемоглобина является обратимое связывание кислорода, что обеспечивается белковой частью гемопротеида.

Поглощение кислорода гемоглобином описывается S-образной кривой. Это указывает на зависимость константы равновесия от степени оксигенации белка в целом и на то, что между отдельными ионами переходного металла имеется некоторое взаимодействие. В молекуле гемоглобина существует n центров связывания, и процесс образования комплекса представляет собой кооперативное взаимодействие нескольких частиц. Для них характерна большая зависимость между конформацией белковой молекулы и каталитической активностью. Их действие не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Связывание одной молекулы субстрата усиливает способность присоединять следующую молекулу: присвязываниикислородасоднойсубъединицейгемоглобинаусиливается дальнейшеевзаимодействиеегосдругимисубъединицами. Зависимостьстепени диссоциацииоксигемоглобинаотвеличиныпарциальногодавленияуглекислоты

вальвеолярном воздухе и крови, при снижении которого сродство кислорода к гемоглобину повышается, что затрудняет переход кислорода из капилляров в ткани. ВлияниерНнасродствогемоглобинаккислородуноситназваниеэффекта Бора. При закислении среды сродство снижается, при защелачивании – повыша-

ется [38].

Глобиновые цепи образуют 8 спиральных сегментов Полинга-Кори (правых D-спиралей) разной длины. Данные сегменты чередуются в цепи с неспиральными участками разной длины [37; 38]. Степень спиральности гемоглобина составляет примерно 75 %. Формирование и стабилизация третичной структуры гемоглобина осуществляются несколькими типами связей, возникающих между боковыми цепями аминокислотных остатков – взаимодействием неполярных боковых радикалов (гидрофобные взаимодействия), Н-связей, электростатических

8

взаимодействий полярных участков аминокислотных остатков. В сборке четвертичной структуры гемоглобина человека большую роль играют С-концевые домены D- и E-цепей [40].

Сборка субъединиц в тетрамерную молекулу сопровождается образованиемсвязеймежду D- и E-цепями. Прямыеконтактысуществуютмеждуатомами неоднотипныхединиц: D1 и E1, D2 и E2. Контакты D1 – E1 и D2 – E2 неполярныиосуществляются 34 аминокислотными остатками, 19 аминокислотных остатков участвуют в формировании контактов D1 – E2 и D2– E1. Однородные субъединицы

вмолекуле гемоглобина либо вообще не контактируют, либо между ними образуются единичные солевые мостики только в дезоксиформе.

На поверхности гемопротеида расположены четыре гидрофобных углубления с размещенными в них гемами диаметром 1,5 нм и высотой 0,75 нм [38]. Два гема соединены с D- цепями на расстоянии 3,5 нм друг от друга, два других

– с E - цепями на расстоянии 2,5 нм. Неполярное окружение гема играет важную рольвпредотвращенииокисленияатомажелезаистабилизируетмакромолекулу

вводной среде [38]. Гистидин (His) способен координироваться с железом гема NH – группой имидазольного кольца или азотом, не связанным с водородом. Усиление связи Fe-N приводит к ослаблению связи железа с лигандом О2 и к увеличению расстояния между этими ядрами, то есть к уменьшению устойчивости комплекса гем-лиганд.

Гемоглобин существует в виде R- и T-конформации [39]. Предполагают наличие Р-конформации с промежуточным сродством к кислороду. Процесс оксигенации начинается с D- цепей и индуцирует каскад конформационных превращений [41]. Присоединение лиганда индуцирует перестройку контактов между субъединицами: D2 - субъединица поворачивается на 16° и сдвигается на 0,21 нм относительно D1 - субъединицы, а E2 – субъединица – на 13,5° и 0,19 нм, E1 – субъединица – на 3,7° и 0,19 нм соответственно. Изменение конформацион-

ной структуры гемоглобина во время оксигенации сопровождается сближением всех 4-х атомов железа между собой и изменением величины угла между осью гемового железа, связанного с D1 – и E1 –цепями, и железа, связанного с D2 – и E2

–цепями [38]. Гемоглобин способен к диссоциации на гем и глобин, а также на мономеры или димеры[42, 43].

Показателем структурного состояния молекул гемоглобина являются его спектральныехарактеристики. Каждоепроизводноегемоглобина(Табл. 2) имеет свои специфические электронные спектры поглощения [44].

9

Таблица № 2 Спектральные характеристики некоторых форм гемоглобина [37]

В спектральной области 220-290 нм светопоглощение обусловлено преимущественно хромофорами ароматических аминокислотных остатков (триптофана, тирозина, фенилаланина), авдиапазонедлинволн290-750 нм– железопорфириновым комплексом. На характер поглощения света железопорфирином сильное влияние оказывает спиновое состояние системы и наличие лигандов с различными лигандовыми полосами. Роль хромофора в геме выполняет система сопряжённых двойных связей. В общую сопряжённую систему включены - электроны всеx двойных связей порфиринового кольца, за исключением двойных связей двух пиррольных колец, которые названы "полуизолированными"

[44].

Полоса Соре отражает переходы типа π-π* порфиринового кольца и частично типа переноса заряда. Низкоинтенсивные полосы при 542 и 572 нм относят к синглет-триплетным переходам. Полоса поглощения при 342 нм обусловлена особенностями железопорфирина, её природа окончательно не ясна. Присоединение того или иного лиганда, изменение спина системы приводит к изменению положения всех трех полос поглощения гемоглобина в видимой области спектра [37].

Помимо кислорода гемоглобин может обратимо присоединять целый ряд низкомолекулярных лигандов. Взаимодействия типа «белок-лиганд» подчиняются ряду закономерностей [45]:

1)приудалениилигандавсегданаблюдаетсяизменениеструктурныхсвойств и/или конформации молекулы белка;

2)масштаб перестроек зачастую не определяется природой лиганда или глубиной его проникновения в белковую молекулу;

3)лиганды различной природы могут оказывать одинаковое влияние на конформацию молекул белка.

Величина pH, соответствующая изоэлектрической точке Hb, равна 6.8, а HbО2– 6.6. Для человека и высших животных важную роль играет буферность

крови, pH которой колеблется от 7.35 до 7.45. Титрование позволяет определить число и тип диссоциирующих групп, их кажущиеся рК и, таким образом, получить дополнительную информацию о структуре (в первую очередь третичной) белка. Перечень ионогенных групп аминокислот и соответствующие им рК приведены в Табл.3 [37].

10