Инновационное развитие науки возможности, проблемы, перспективы. Часть IV. Монография

Помимо определения количества титруемых ионогенных групп кислотноосновное титрование позволяет получить информацию:

1)о взаимодействии ионогенных групп белка с лигандом;

2)о группах, ответственных за поддержание вторичной и третичной структур биополимеров;

3)о поверхностном заряде на мембране;

4)о взаимодействии протонов с мембранами;

5)о существовании или отсутствии рН-зависимых конформационных состояний белковой молекулы, что, в свою очередь, может дать информацию о функции белка.

6)о значении pK и доступности титранту функциональных групп аминокислотных остатков белка;

7)о числе и типе диссоциирующих групп;

Число связанных протонов равно разности между общим числом добавленных протонов и числом свободных протонов, которое измеряется потенциометрически. Максимальное число связанных белком протонов можно получить при значении рН раствора белка около 1.5.

Из кислых реагентов для титрования белков обычно применяют соляную кислоту, не имеющую побочных отрицательных свойств. По аналогичным причинам для титрования щелочью применяют КОН. Ионную силу раствора в процессе титрования поддерживают на определенном уровне [37].

Д. Кеннан разделил кривую титрования на участки следующим образом:

1)титрование от рН=1.5 до рН=6 обусловлено отщеплением протонов боковых карбоксильных групп;

2)титрование от рН=6 до рН=8.5 обусловлено взаимодействием ионов водорода с имидазолом гистидина и концевыми D - аминогруппами;

3)титрование от рН=8.5 до рН=11.5 обусловлено H - аминогруппами, фенольными и сульфгидрильными группами;

4)аргинин при титровании не определяется;

11

5) из данных титрования от изоионной точки до точки вблизи рН=1.5 получают величины, числено равные содержанию основных групп, независимо от того, какие группы играют роль в процессах ионного равновесия.

Спектр буферной емкости ( E (рН)) представляет собой первую производную по рН от кривой связывания протонов. Зависимость буферной емкости от рН (спектр буферной емкости) может быть разложена на пики, которые соответствуют различным ионогенным группам, а значение рН в максимумах этих пиковсоответствуетрКионогенных групп. Ванализеспектров буферной емкости применим подход анализа спектральных кривых [37].

1.2.Аминогликозиды. Амикацин

Аминогликозиды получили своё название в связи с наличием в молекуле аминосахаридов, соединенных гликозидной связью с агликоновым фрагментом. Структурным элементом антибиотиков-аминогликозидов является 2-дезокси-D- стрептамин [46]. Предполагается, что начальным этапом их действия на клетки прокариот является пенетрация через клеточную стенку путем пассивной диффузии, и, возможно, путем активного транспорта через кислородзависимые механизмы. Послетого, какаминогликозидпрониквклетку, онсвязываетсясоспецифическими белками-рецепторами на 30 S субъединице бактериальной рибосомы. Вследствие этого нарушается образование инициирующего комплекса между матричной РНК и 30 S субъединицы рибосомы. Происходит распад полисом в нефункционирующие моносомы. Возникают дефекты при считывании с ДНК, синтезируются неполноценные белки, что приводит к остановке роста и развития микробной клетки.

Привысокихконцентрацияхаминогликозидовпроисходитповреждение цитоплазматической мембраны, и клетка гибнет [14; 16]. Все аминогликозиды имеют широкий спектр действия. Все они обладают характерными токсическимисвойствами– нефротоксичностьюиособенноототоксичностью[10; 15], могут вызывать нейромышечный блок с развитием несостоятельности дыха-

ния [33].

В настоящее время (Табл. 4) выделяют три поколения аминогликозидов

[14, 16]:

Таблица № 4 Представители отдельных поколений аминогликозидов

Амикацин – представитель 3 поколения аминогликозидов. Его назначаютреже, чемпенициллины илицефалоспорины, ноширокийспектрего воздействия позволяет уничтожить патогенные микроорганизмы, поражающие различные системы и органы (Рис. 1).

12

HO O

HO

Рисунок 1. Структурная формула амикацина

N'-[4-Амино-2-(S)-гидроксибутирил]-0-6-амино-6-дезокси-a-D-глю-копиранозил(1->4)]-О-[3- амино-3-дезокси-a-D-люкопиранозил (1->6)]-2-дезокси-D-стрептаминадисульфат

Брутто-формула C22H43N5O13, Mr = 585,6 г/моль

Амикацин– аморфныйпорошокбелогоилибелогосжелтоватымоттенком цвета. Легко растворим в воде. Гигроскопичен. Получен полусинтетическим путем из канамицина А [14]. Амикацин является одним из наиболее активных ан- тибиотиков-аминогликозидов. Обладает широким спектром антибактериальной активности. Эффективен в отношении грамположительных и особенно грамотрицательных бактерий. Действует на многие штаммы грамотрицательных бактерий (в том числе P. aeruginosa), резистентные к гентамицину и другим аминогликозидам II поколения. Активен против M. tuberculosis. Не действует на энтерококки. По сравнению с гентамицином несколько менее нефротоксичен [10; 16].

Амикациниспользуетсядлялеченияинфекций, вызванныхполирезистентной грамотрицательной микрофлорой. Наиболее предпочтителен среди аминогликозидов для эмпирической терапии нозокомиальных инфекций: нозокомиальная пневмония; инфекции МВП; интраабдоминальные и тазовые инфекции (в сочетании с антианаэробными препаратами); сепсис (в сочетании с β-лакта- мами); туберкулёз (препарат II ряда)[14].

Амикацин применяют внутримышечно и внутривенно. Растворы амикацина сульфата готовят непосредственно перед применением. Концентрация раствора амикацина при введении в вену не должна превышать 5 мг в 1 мл. Независимоотспособавводят(взрослым) по 0,5 гпрепарата2 - 3 раза всуткивтечение 7 - 10 дней. При неосложненных инфекциях мочевых путей (кроме инфекций, вызванных синегнойной палочкой) вводят внутримышечно по 0,25 г 2 раза в день в течение 5 - 7 дней. Максимальная суточная доза составляет 1,5 г. При нарушении выделительной функции почек дозу снижают или увеличивают интервалы между инъекциями. В случае отсутствия лечебного эффекта в течение 5 днейпереходятналечениедругимипрепаратами. Возможныеосложненияипротивопоказания такие же, как при применении других антибиотиков-аминоглико- зидов [14; 16]. Амикацин практически не всасывается из ЖКТ, его вводят внутривенно и внутримышечно. Связывание с белками плазмы – 4-11%. Амикацин

13

легкопроходитгистогематическиебарьеры, экскретируетсявосновномпочками (65-94 %) в неизменном виде путем клубочковой фильтрации.

1.3.Цефалоспорины. Цефтазидим

Цефалоспорины относятся к β-лактамам. Выделяют четыре поколения цефалоспоринов, причем первые три представлены препаратами для парентерального и перорального применения (Табл. 5).

Благодаря высокой эффективности и низкой токсичности, цефалоспорины занимают одно из первых мест по частоте клинического использования среди всех антимикробных препаратов [14; 16].

Цефтазидим – цефалоспориновый антибиотик III поколения для парентерального применения. Действует бактерицидно. Нарушает синтез клеточной стенки микроорганизмов. Обладает широким спектром действия. Устойчив к действию большинства бета-лактамаз (Рис. 2).

14

O

CH3 CH3

O OH

Рисунок 2. Структурная формула цефтазидима

[6R-[6альфа,7бета(2) ]]-1-[[(2-амино-4-тиазолил) [(1-карбокси-1-метилэтокси)амино]аце- тил]амино]-2-карбокси-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло[4.2.0]окт-2-ен-3-ил]метил] пиридиния гидроксид

Брутто-формула C22H22N6O7S2, Mr = 546,58 г/моль

Висследованиях in vitro было показано, что фортум (цефтазидим) активен

вотношении грамотрицательных бактерий: P. aeruginosa, Pseudomonas spp.,

Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Providencia spp., Escherichia coli, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Pasteurella multocida, Acinetobacter spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Haemophilus parainfluenzae; грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus spp., Streptococcus spp. (исключая Streptococcus faecalis); анаэробныхбактерий: Peptococcus spp., Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringers и др. [16].

Терапевтические концентрации активного вещества в плазме крови сохраняются на протяжении 8-12 ч. Связывание с белками плазмы – 10%. Цефтазидим плохо проникает через неповрежденный гемато-энцефалический барьер. Цефтазидим не метаболизируется. Приблизительно 80-90% дозы выделяется с мочой в течение 24 ч.

Цефтазидим может использоваться без сочетания с другими антибактериальными средствами в качестве препарата первого выбора до тех пор, пока не будут получены данные о чувствительности микроорганизмов. Цефтазидим может использоваться в комбинации с аминогликозидами и большинством других антибиотиков, устойчивых к действию бета-лактамаз. Цефтазидим может использоваться в сочетании с другими антибиотиками при анаэробных инфекциях, если предполагается присутствие Bacteroides fragilis.

Побочное действие: со стороны пищеварительной системы: диарея, тошнота, рвота, боли в животе, транзиторное повышение активности трансаминаз, редко – стоматит, колит (в т.ч. псевдомембранозный). Со стороны системы кроветворения: эозинофилия; очень редко – лейкопения, нейтропения, агранулоцитоз, тромбоцитопения, лимфоцитоз. СостороныЦНСипериферическойнервной системы: головные боли, головокружение, парестезии, нарушение вкусовых ощущений; у пациентов с почечной недостаточностью при неправильном подборе дозы – тремор, судороги, энцефалопатия. Прочие: положительная реакция Кумбса без гемолиза, транзиторное повышение уровня креатинина сыворотки

15

крови. Эффекты, обусловленные биологическим действием: суперинфекция (кандидоз, в т.ч. слизистой оболочки влагалища) [16].

Таблица № 6

Рекомендуемые поддерживающие дозы

2.Методы исследования

Вопытах применяли эритроциты, полученные из крови доноров путем трехкратного отмывания эритромассы центрифугированием в физиологическом растворе NaCl (0,9 %) в течение 10 мин. Содержание клеток в образцах контролировали спектрофотометрически с помощью спектрофотометра Shimadzu UV2401 PC (Япония).

Методом протолитометрического титрования (иономер И-130, закисление среды до рН=3, 0,1н HCl) и абсорбционной спектрофотометрии (спектрофото-

метр «Shimadzu UV-2401 PC», O= 200–650 нм, кварцевые кюветы с l = 10 мм) исследовали структурно-функциональное состояние гемоглобина, выделенного из крови доноров методом осмотического гемолиза эритроцитов, предварительно инкубированных с антибиотиками в течение 60 мин.

В работе использовали растворы одноименных фармакологических препаратов цефтазидима и амикацина, которые готовили в изоосмотическом (0,9%) растворе NaCl непосредственно перед экспериментом. Оценку воздействия примесных веществ на эритроциты мы не проводили ввиду их низкого содержания в препарате (не более 1%). Расчет концентрации антибиотиков проводили на основании известной Cmax препаратов в крови: цефтазидим 100 мг/кг, амикацин 15

мг/кг [14, 16, 21].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы Microsoft Exсel. Рассчитывали средние значения вариант в группе из 4-5 образцов крови разных доноров и стандартные отклонения. Полученные данные обрабатывали с использованием параметрических критериев (p<0,05).

16

3. Обсуждение результатов

Исследование спектральных характеристик водных растворов исследуемых антибиотиков позволило установить, что цефтазидим имеет выраженный максимум при 260 нм, а амикацин – при 220 нм, т.е. они не перекрываются с пиками, характерными для белковой (~272 нм) и гемовой (~412, ~542 и ~576 нм) частями спектра оксигемоглобина человека.

Исследование спектральных характеристик растворов оксигемоглобина, модифицированных изучаемыми антибиотиками, показало, что воздействие амикацина и цефтазидима вызывает незначительное повышение его оптической плотности в белковой части спектра (на ≈6 и ≈4%) и в области полосы Соре (на ≈10 и ≈4% соответственно), что указывает на слабое сродство молекул антибиотиков к полипептидным цепям гемопротеида (рис. 3). При этом амикацин индуцировал статистически достоверное повышение оптической плотности раствора и при 542 и 576 нм (в среднем на 12%) относительно контроля. Это свидетельствует о более глубоких конформационных перестройках глобинового компонентаоксигемоглобинаввидуассоциациимолекулантибиотикасгидрофобными участками полипептидных цепей. Повышение гидрофобности и, как следствие, доступностискрытыхучастковбелкаамфифильномуреагентуприводиткнакоплению молекулярных деформаций и комплексов типа "реагент – аминокислотный остаток".

Рисунок 3. Электронные спектры поглощения растворов оксигемоглобина человека, модифицированного амикацином и цефтазидимом. Обозначения: 1 – контроль; 2 – HbO2+амкацин; 3 –HbO2+цефтазидим

При анализе типов химических взаимодействий ионогенных групп белка с функциональными группами антибиотиков установлено, что цефтазидим и амикацин индуцируют конформационную перестройку гемопротеида посредством комплексирования с карбоксильными группами остатков аспарагиновой и глутаминовой аминокислот белка, что находит отражение в снижении относительной буферной ёмкости гемопротеида ('V) относительно контроля (нативный раствор оксигемоглобина).

17

Химическое взаимодействие цефтазидима с имидазольными группами гистидина и сульфгидрильными – лизина и тирозина – подтверждается снижениемпараметра'V всреднемна20% относительноконтролявобластяхрН=5- 9 и рН=9-11 соответственно.

-40

-60

-80

-100

-120

Рисунок 4. Относительная буферная емкость водных растворов оксигемоглобина человека, модифицированных амикацином и цефтазидимом в терапевтической концентрации

Как следует из представленных данных, в исследуемом диапазоне рН амикацин способствовал повышению параметра 'V относительно контроля на 20% и на 5%, что свидетельствует о разворачивании белковой глобулы и увеличении количества ионогенных групп, доступных для титрования. По всей вероятности, выявленные особенности в типах и выраженности химических взаимодействий использованных антибиотиков и обуславливают различия в характере и силе химической модификации белковых компонентов эритроцитарных мембран. К ним относятся:

1)привзаимодействиицефтазидимас белкамипроисходиткомплексное его воздействие на карбоксильные и аминогруппы(в результате этого возможно изменение как суммарного отрицательного, так и суммарного положительного заряда, которые несут карбоксильные группы гистидина, а также лизина);

2)амикацин характеризуется как слабый химический реагент при его взаимодействии с карбоксильными группами с одной стороны, и денатурирующий реагент с другой стороны, вызывающий частичное разворачивание белковой глобулы – это, в свою очередь, позволяет относить эти антибиотик к

18

химическим реагентам, которые проявляют двойственную природу, для которых предпочтительным является связывание с карбоксильными группами и частично с гистидином.

Подобные свойства обуславливает, прежде всего, изменение буферной ёмкости белковых молекул преимущественно в нейтральной области, что может привести к нарушению функциональных свойств транспортных белков крови. Данные, полученные методом протолитометрического титрования, подтверждают результаты исследования термоустойчивости водных растворов оксигемоглобина в присутствии изучаемых антибиотиков: молекулярные комплексы цефтазидима и амикацина с оксигемоглобином характеризуются повышением термоустойчивости его растворов по сравнению с немодифицированным гембелком [47].

Заключение

Анализ полученных данных позволил заключить, что исследуемые в опытах антибиотики обладают определенной чувствительностью к молекулам гемоглобина. Характер воздействия модификатора на конформационное состояние гемопротеида определяется его химической структурой. Связываясь частично или полностью с ионогенными группами гемоглобина, антибиотики вызывают изменения буферных и структурно-функциональных свойств белковой глобулы.

При исследовании относительной буферной ёмкости гемоглобина, модифицированногоамикациномицефтазидимом, установлено, чтоданныеантимикробные препараты вызывают статистически достоверные изменения буферной ёмкости водных растворов гембелка в широких интервалах рН (3-11), обусловленные реакциями взаимодействия между модификаторами и ионогенными группами гемоглобина. Выявлено, что во всех исследуемых областях рН = 3 – 5, соответствующей карбоксильным группам гемоглобина, рН = 5 – 9 (ионогенные группы гистидина), рН = 9 – 11 (ионогенные группы тирозина и лизина) цефтазидим индуцировал большие изменения относительной буферной емкости белка по сравнению с амикацином. По всей вероятности, выявленные особенности в типах и выраженности химических взаимодействий использованных антибиотиков могут обуславливать различия в характере и силе химической модификации белковых компонентов эритроцитарных мембран вкупе с особенностями их пространственной структуры.

Установленные нами типы химического связывания модификаторов с образованием прочных комплексов, приводящих к различным по выраженности структурным изменениям белков, нашли своё отражение в изменении электронных спектров поглощения водных растворов гемоглобина, модифицированного данными антибиотиками. Использованные нами антимикробные препараты вызывали статистически достоверное изменение спектральных характеристик гембелка. Особую активность при этом проявляли цефтазидим и, в меньшей степени, амикацин. При этом установлено, что исследуемые антимикробные препараты оказывают влияние на простетическую и белковую части молекулы гемоглобина. На основании результатов проведенных серий опытов нами составлена

19

обобщённая схема возможных структурных превращений в гемоглобине, индуцированных амикацином и цефтазидимом.

Рисунок 5. Обобщенная схема структурно-функциональных превращений в оксигемоглобине человека в присутствии амикацина и цефтазидима

Литература

1.Сипливая Л. Е., Шевцова Е. М., Лазарев А. И., Прокопенко А. Г. Иммуномодулирующее действие аминогликозидных антибиотиков при различных технологиях введения / Антибиотики и химиотерапия. 1999. – №2. –С. 29 – 32.

2.Лазарев А. И., Братчиков О. И., Сипливая Л. Е., Сипливый Г. В., Шумакова Е. А., Кукурека А. В. Иммуномодулирующая, гепатопротекторная и антиоксидантная активность иммобилизованных форм аминогликозидных

20