Инновационные биотехнологии переработки растительного сырья. Лабораторный практикум

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

« САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра «Технология пищевых производств и биотехнология»

П.А. ЧАЛДАЕВ, А.Г. КАШАЕВ, О.Е. ТЕМНИКОВА

ИННОВАЦИОННЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Лабораторный практикум

Самара Самарский государственный технический университет

2019

1

Печатается по решению ученого совета СамГТУ (протокол № 8 от

29.03.2019 г.)

УДК 664.8 (076.5) ББК 36.91я73

Ч-16

Чалдаев П.А.

Ч-16 Инновационные биотехнологии переработки растительного сы-

рья: лабораторный практикум / П.А. Чалдаев, А.Г. Кашаев, О.Е. Темникова. –

Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2019. – 48 с.

Описаны современные биотехнологические приемы интенсификации технологических процессов переработки растительного сырья, основанные на применении ферментных препаратов и активации микроорганизмов.

Предназначен для магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология».

Р е ц е н з е н т д-р биол. наук, доцент Е.Ю. Руденко

УДК 664.8 (076.5) ББК 36.91я73

Ч-16

© П.А. Чалдаев, А.Г. Кашаев, О.Е. Темникова, 2019

© Самарский государственный технический университет, 2019

2

ВВЕДЕНИЕ

«Инновационные биотехнологии переработки растительного сырья» является одной из важнейших дисциплин, которые изучают магистранты, обучающиеся по направлению 19.04.01 «Биотехнология». В процессе выполнения лабораторных работ магистранты изучают современные биотехнологические приемы интенсификации технологических процессов переработки растительного сырья, основанные на применении ферментных препаратов и активации микроорганизмов, а также осваивают элементы научно-исследовательской деятельности в процессе постановки лабораторных экспериментов.

Лабораторный практикум для магистрантов составлен с учетом часов, отведенных учебным планом на лабораторные занятия. Программой предусмотрено выполнение лабораторных занятий по основным разделам курса для закрепления теоретических знаний по инновационным биотехнологиям переработки растительного сырья.

Допуск магистрантов к занятиям проводится по теоретической части изучаемой тематики курса. Каждая работа имеет задание, требования по оформлению, контрольные вопросы. Качество выполнения заданий контролируется путем устных опросов.

3

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

Одним из развивающихся направлений совершенствования технологий переработки растительного сырья является его биоконверсия с использованием ферментных препаратов. Ферменты используют в основном на начальной, наиболее трудоемкой стадии переработки растительного сырья, когда необходимо расщепить структурные или запасные компоненты, а также на заключительных стадиях – с целью сохранения качества пищевых продуктов или улучшения органолептических свойств.

Строение ферментов. Ферменты (энзимы) – высокоспециализированный класс белковых веществ, способных катализировать химические реакции в живых организмах. Их можно разделить на простые (однокомпонентные) и сложные (двухкомпонентные). Установлено, что большинство гидролитических ферментов относится к простым. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы (оксидоредуктазы), синтез веществ (лигазы), а также реакции переноса групп (трансферазы), обычно принадлежат к сложным ферментам.

Всостав сложных ферментов входит простой белок и вещества небелковой природы (ионы металлов или различные, сложные органические соединения). Фермент, состоящий из неактивной белковой части (апофермента) и активирующей ее небелковой группы (кофактора), называют холоферментом.

Взависимости от прочности связи кофактора с апоферментом кофакторы бывают двух видов:

−простетическая группа – добавочная группа, прочно связанная

сапоферментом и не отделяемая от него;

−кофермент – легко отделяемый от апофермента, обслуживающий два или несколько ферментов и способный к самостоятельному существованию.

Характерной особенностью сложных ферментов является то, что комплекс белка и добавочной группы обеспечивает ферментативную

4

активность. Действие большинства ферментов осуществляется на уровне третичной структуры белков, а у некоторых ферментов – на уровне четвертичной структуры.

Основные свойства ферментов заключаются в их высокой ка-

талитической активности, специфичности, лабильности и обратимости действия.

Ферменты проявляют высокую активность, катализируя превращения субстратов при очень малых концентрациях. Активность фермента выражают количеством молей субстрата, превращаемого в продукт реакции одним молем фермента за 1 мин при оптимальных значениях рН и температуры.

Для ферментов характерна лабильность – способность менять свою активность в зависимости от внешних факторов (температуры, рН среды, присутствия в среде ряда химических соединений и др.).

Являясь белками, ферменты чувствительны к изменению действия температуры. Они легко инактивируются (теряют ферментативную активность) при нагревании в связи с начинающейся денатурацией белка. Температурный оптимум для большинства ферментов – 37–40 ° С. При нагревании выше 50–60 ° С каталитическая активность многих ферментов снижается, выше 80 ° С – большинство ферментов инактивируются, а при 100 ° С – инактивируются практически все ферменты. Снижение температуры от оптимума ведет к обратимому снижению активности ферментов вследствие замедления движения, а следовательно, снижению возможности столкновения молекул фермента и субстрата.

Каждый фермент проявляет наибольшую активность при определенном значении рН. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН вблизи нейтральной точки, соответствующей изоэлектрической точке фермента. При изменении рН среды от оптимума в щелочную или кислую стороны снижается активность фермента. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты.

На активность ферментов также влияет присутствие в растворе ряда химических соединений, так называемых активаторов и ингибиторов.

5

Ферментативному катализу свойственна обратимость действия, т. е. один и тот же фермент в одних условиях способен ускорять реакцию синтеза, в других – распада.

К числу весьма характерных свойств ферментов относят их специфичность действия. Специфичность заключается в том, что каждый фермент может катализировать одну или несколько близких по природе химических реакций. Различают абсолютную и групповую специфичность. При абсолютной специфичности фермент катализирует превращение только одного определенного субстрата, т. е. действие фермента связано с химической природой субстрата. К ферментам с групповой специфичностью относят ферменты, субстратами для которых являются несколько химических соединений, построенных по одному типу, действие таких ферментов адаптировано к типу химической реакции.

Классификация и номенклатура ферментов. В основу приня-

той классификации ферментов положен тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата. При этом выделено шесть классов ферментов.

1.Класс оксидоредуктаз включает ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза».

2.Класс трансфераз охватывает ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов

ирадикалов. Наименование их составляется по форме: «донор: транспортируемая группа-трансфераза».

3.Класс гидролаз объединяет большую группу ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды. Наименование их составляют по форме «субстрат-гидролаза».

4.Класс лиаз – ферменты, катализирующие разрыв связей С-О, С-С, С-N и др., а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов негидролитическим путем. Эти реакции сопро-

6

вождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Ферменты обозначают термином «суб- стра-лиазы».

5.Класс изомераз – ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров. Название их составляют с учетом типа реакции: «субстрат – цис-транс-изомераза».

6.Класс лигаз (синтетаз) – ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух молекул с использованием энергии распада АТФ. Название их составляют по форме «X : Y лигаза», где X и Y обозначают исходные вещества.

Согласно принятой международной системе всем ферментам присвоен индивидуальный классификационный номер (шифр). Каждый классификационный номер содержит сокращение «КФ» (классификация ферментов) и последовательность из четырех чисел, разделенных точкой, и составляется по определенному принципу. Каждое последующее число представляет собой все более и более уточняющую классификацию фермента (класс, подкласс, подподкласс, порядковый номер в подподклассе).

Ферментативная переработка растительного сырья. При про-

изводстве пищевых продуктов используются различные виды органического сырья, что предопределяет важную роль ферментов в процессах заготовки, хранения сырья и его переработки. Ферменты, участвующие в трансформации органического сырья, можно условно разделить на четыре группы:

− ферменты, содержащиеся в сырье; − ферменты сопутствующей микрофлоры сырья;

− ферменты системы культурных штаммов микроорганизмов; − ферментные препараты (растительного, микробного и живот-

ного происхождения).

Из группы ферментов, содержащихся в сырье, наиболее важными являются гидролитические и окислительно-восстановительные ферменты.

Наличие в сырье гидролитических ферментов в начальной стадии

производства многих пищевых продуктов предопределяет ход техно-

7

логического процесса и качество готовой продукции. При недостаточной активности гидролаз сырья применяют обработку ферментными препаратами.

При заготовке и хранении сырья ферментативные процессы, как правило, являются отрицательным фактором. Технологические приемы заготовки и хранения пищевого сырья зачастую направлены на ограничение активности ферментов, прежде всего гидролитических и окислительно-восстановительных, действие которых приводит к снижению качества большинства видов растительного и животного сырья. Хорошо известна отрицательная роль оксидоредуктаз при переработке свежего растительного сырья.

На качество сырья и продуктов его переработки влияют ферменты сопутствующей микрофлоры сырья, многие виды которой обладают высокой активностью гидролитических ферментов. Такие виды вызывают быструю порчу сырья, а получаемые из поврежденного сырья продукты имеют низкое качество.

Ферментные системы окультуренных штаммов микроорганизмов с давних времен используются в производстве разнообразных продуктов брожения, сыров, хлеба, ферментированных соусов и др. Методы микробиологии и селекции повысили ферментативную активность промышленных микроорганизмов. Разработка способов иммобилизации микробных клеток существенно увеличила операционную стабильность ферментных систем и расширила возможности их технологического использования. Однако основной признак ферментов этой группы остался неизменным – строгая локализация внутри клеток. Поэтому такие ферментные системы не выделяют из клеток, а используют клетки как носители ферментных систем.

Ферментные препараты так же, как и ферментные системы культурных штаммов микроорганизмов, введены в переработку органического сырья в результате длительной практической деятельности человечества. Эту группу ферментов получают в виде препаратов, активная часть которых может быть растворимой или находиться в связанной (иммобилизованной) форме. Используются также индивидуальные ферменты, локализованные в клетках. От ферментных систем

8

культурных штаммов микроорганизмов они отличаются тем, что не входят в системы синтеза метаболитов и внутриклеточная локализация не является непременным условием их функционирования.

Источники получения ферментных препаратов. При перера-

ботке различных видов органического сырья используются ферменты растительного, животного и микробного происхождения.

Растительные ферменты специфичны в отношении своих естественных субстратов, что определяет высокую эффективность их действия на растительное сырье. Источниками являются проросшее зерно (солод) различных культур, соки дынного дерева, зрелых стеблей ананаса и тропического инжира и др.

Животные ферменты. Из животного сырья получают ограниченный ассортимент ферментных препаратов, которые, как более дорогостоящие, применяются реже микробных. Получают ферментные препараты животного происхождения в основном из органов и тканей животных.

Микробные ферменты. Основная масса ферментных препаратов производится на основе культивирования промышленных штаммов микроорганизмов, преимущественно продуцентов секретируемых (внеклеточных) ферментов.

Специфичность микробных ферментов совершенствовалась в процессе эволюции сапрофитных и фитопатогенных форм микроорганизмов. В микробном мире можно найти продуцентов всевозможных ферментов, участвующих в круговороте органического вещества. Это объясняет широкое применение микробных ферментов в пищевой промышленности.

В качестве продуцентов ферментов используются культуры представителей различных таксонометрических групп – бактерий, актиномицетов, микроскопических и высших базидиальных грибов.

Бо<льшую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (прежде всего, B. subtilis), микроскопических грибов родов Aspergillus,

Penicillium, Trichoderma, а также актиномицетов родов Actinomyces,

Streptomyces. Чаще всего используют мезофильные штаммы аэробных микроорганизмов [10].

9

Лабораторная работа № 1 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

В СПИРТОВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Производство спирта основано на конверсии сбраживаемых органических соединений в этанол с помощью дрожжей-сахаромицетов. Основным сырьем в нашей стране для этого служат зерновые культуры, картофель и свекловичная меласса.

Для того чтобы повысить выход спирта из крахмалсодержащего сырья, следует решить две задачи:

1)полностью гидролизовать крахмал и некрахмальные полисахариды в сбраживаемые сахара;

2)обеспечить дрожжи питательными элементами, необходимыми для быстрого размножения и синтеза ферментов.

Осахаривание крахмала осуществляют с использованием солода или микробных препаратов амилолитического действия – α-амилазы

иглюкоамилазы [10].

α-Амилазы (α-1,4-глюкан-глюкангидролазы) изначально были обнаружены в солоде, а затем в плесневых грибах (например, в Aspergillus oryzae), бактериях (например, в Bacillus subtilis), а также в слюне человека и животных (фиталин), поджелудочной железе (панкреатин). Будучи эндоферментами α-амилазы оказывают сильный ожижающий и слабый осахаривающий эффекты. Под действием α- амилазы гликозидные α-1,4-связи в амилозе крахмала случайным образом расщепляются с образованием неразветвленных декстринов среднего размера (олигосахариды), не реагирующих с йодом.

При температуре 70– 75 ° С небольшие добавки α-амилазы быстро ожижают амилопектиновую пасту. Этот процесс ожижения сопровождается образованием разветвленных фрагментов (предельных декстринов). Действие α-амилазы блокируется образующейся мальтозой и возобновляется только с началом ферментации последней, оставшиеся декстрины при этом полностью осахариваются.

10