Инновационные биотехнологии переработки растительного сырья. Лабораторный практикум

Активность α-амилаз из разных источников меняется по-разному и зависит от температуры и значения рН. Для практических целей особенно важна зависимость от температуры. Оптимальные температуры для грибной α-амилазы примерно на 20 ° С ниже, чем для бактериальных, что нашло практическое применение. При этом бактериальные α-амилазы образуют декстрины быстрее, чем грибные.

Для повышения эффективности и стабильности микробиальных α-амилаз необходимо использовать добавки ионов кальция (Са2+). Внесение солей кальция уже используется в промышленности, особенно при переработке картофеля.

Поскольку оптимальные значения рН первых технических α- амилаз были довольно высоки (около 6), то рН заторов в большинстве случаев требовалось повышать, и для этого, а также для внесения ионов кальция с успехом использовали гашеную известь – Са(ОН)2.

В настоящее время в распоряжении технологов имеются технические бактериальные α-амилазы, обладающие высокой активностью без добавления ионов кальция, которые сохраняют активность до рН 5,0 и температур 90 ° С и эффективно ожижают картофельный затор, содержания ионов кальция в котором для них достаточно.

Отличительной чертой грибных α-амилаз из А. oryzae является повышенное образование мальтозы, что положительно сказывается на процессе ферментации.

Глюкоамилаза – это важный фермент, участвующий в осахаривании крахмала. Она обнаружена в плесенях, например, в Aspergillus niger. Будучи экзоферментом глюкоамилаза отщепляет глюкозный фрагмент с редуцирующих концов амилозы и амилопектина, причем разветвления амилопектина ферментной атаке не мешают. Этим ферментом декстрины, мальтотриоза и другие сахара гидролизуются до глюкозы. Если для полного осахаривания крахмала необходимо действие нескольких солодовых ферментов, то микробиальная глюкоамилаза может сделать это одна, но она гидролизует крахмал значительно медленнее, чем солодовые ферменты, поскольку воздействует только на концы цепей. Для ускорения гидролиза крахмала необхо-

11

димо дополнительно внести α-амилазу, которая выполняет для глюкоамилазы «предварительную работу», образуя декстрины и, следовательно, увеличивая число концов цепей.

Оптимальными условиями для глюкоамилазы являются температура 60 ° С и значение рН от 4,0 до 5,2, но этот фермент достаточно активен в диапазоне рН ниже 3,5 и выше 5,5. Из этого, однако, не следует, что для проведения ферментации среду необходимо подкислять [12].

Важно значение имеет гидролиз некрахмальных полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлозы, β-глюкана и др.) зернового сырья. Это способствует увеличению выхода сбраживаемой глюкозы, а также повышению доступности крахмала ферментативному гидролизу. С этой целью используют ферментативные препараты целлюлолитического действия.

Для гидролиза белковых веществ используют ферментные препараты протеолитического действия, позволяющие обогатить среду свободными аминокислотами, необходимыми для активного размножения дрожжевых клеток [10].

Этиловый спирт наилучшего качества («Альфа», «Люкс») в соответствии с ГОСТ 5962-2013 [9] вырабатывают только из зерна. Процесс производства включает следующие технологические операции:

–дробление зерна;

–приготовление замеса;

–водно-тепловая и ферментативная обработка замеса;

–получение и сбраживание осахаренного сусла;

–перегонка зрелой бражки.

Дробление сырья необходимо проводить таким образом, чтобы получить помол максимально мелкого и однородного состава. При тонком измельчении сырья улучшаются условия гидролиза его составных частей, в том числе частично целлюлозы и гемицеллюлозы клеточных стенок. Измельчение сырья до размеров частиц не более 0,25 мм позволит разваривать его при температуре не выше 100 ° С.

Приготовление замеса заключается в смешивании измельченного сырья с водой и подогреве его до определенной температуры.

12

При водно-тепловой и ферментативной обработке зерна выбирают такой режим, чтобы провести процесс, при котором разрушается клеточная структура сырья и переходят в растворимое состояние крахмал и другие компоненты зернового сырья [1].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Цель работы – приготовление сусла спиртового производства с использованием ферментных препаратов, изучение влияния ферментных препаратов на эффективность процесса осахаривания разваренной массы и качество сусла из различных видов зерна.

Материалы, оборудование, реактивы:

−мельница лабораторная;

−сито диаметром 1 мм;

−весы технические;

−электроплитка;

−водяная баня;

−термометр технический с диапазоном измерения температур

0– 100 ° С;

−рефрактометр;

−pH-метр;

−глазная пипетка;

−стаканы вместимостью 50 см3;

−стаканы для замеса вместимостью 600– 1000 см3;

−пробирки вместимостью 10 см3;

−стеклянная палочка;

−мерный цилиндр вместимостью 500 см3;

−воронка диаметром 100– 150 мм;

−бюретка вместимостью 25 см3;

−пипетка вместимостью 20 см3;

−мерный цилиндр вместимостью 250 см3;

−конические колбы вместимостью 250 см3;

−дистиллированная вода;

−раствор гидроксида натрия концентрацией 0,1 моль/дм3;

13

−раствор фенолфталеина в этиловом спирте концентрацией

10 г/дм3;

−раствор йода 3 %-ный;

−марля;

−ватные диски;

−зерно различных культур;

−ферментные препараты амилолитического действия и/или мультиэнзимные препараты.

Последовательность выполнения работы

1. Получение проб сусла спиртового производства

Для проведения работы берут зерно нескольких культур и ферментные препараты амилолитического действия и/или мультиэнзимный препарат по указанию преподавателя.

Помол зерна производят на лабораторной мельнице так, чтобы все размолотое зерно (помол) при просеивании прошло через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Приготовление зернового замеса заключается в смешивании измельченного сырья с водой в определенном соотношении (гидромодуль замеса). Для этого с помощью мерного цилиндра отмеряют 400 см3 питьевой воды, помещают в стакан для замеса и нагревают на водяной бане до необходимой температуры. На технических весах отвешивают 100 г измельченного сырья и вносят при перемешивании в стакан с подогретой водой.

Для осахаривания крахмала используют ферментные препараты α-амилазы и глюкоамилазы и/или мультиэнзимные препараты. Дозировки препаратов, продолжительность и температуры процесса осахаривания выбирают в соответствии с инструкцией к используемым препаратам.

Контроль процесса осахаривания проводят по йодной пробе. Для этого предварительно наполняют 10 пробирок на 2/3 объема водой, добавляют в каждую 1– 2 капли 3 %-ного раствора йода и в процессе про-

14

ведения осахаривания периодически отбирают пробы стеклянной палочкой, внося их последовательно в приготовленные пробирки. Наблюдают изменение окраски в пробирках. Последовательные пробы обнаруживают постепенное изменение окраски при реакции с йодом (синюю, сине-фиолетовую, красно-фиолетовую, красноватооранжевую, оранжевую, желтую). Процесс заканчивают, когда окраска в последней пробирке не будет изменяться от внесения пробы сусла.

Отмечают продолжительность процесса для различных видов зерна и используемых ферментных препаратов.

Полученное сусло фильтруют в другой стакан через несколько слоев марли, охлаждают до 20 ° С и анализируют по органолептическим и физико-химическим показателям.

2. Оценка качества проб сусла

по органолептическим показателям

Пробы сусла оценивают по следующим органолептическим показателям качества: внешний вид, цвет, вкус и аромат.

3. Оценка качества проб сусла

по физико-химическим показателям

3.1. Определение массовой концентрации сухих веществ

Массовую долю сухих веществ в сусле определяют рефрактометрическим методом с применением специального прибора – рефрактометра. Метод основан на зависимости показателя угла преломления луча света, проходящего через сусло, от массовой доли сухих растворимых веществ в этом сусле. Используют прибор, отградуированный по сахарозе.

В камерах призм рефрактометра циркуляцией воды, имеющей температуру (20±0,5) ° С, поступающей из термостата, устанавливают температуру, равную (20,0±0,5) ° С. Затем поднимают верхнюю призму и глазной пипеткой наносят на поверхность нижней призмы 3– 4 капли дистиллированной воды, закрывают камеру и устанавливают окуляр так, чтобы ясно была видна шкала и визирная линия, расположенная в окулярной части зрительной трубы.

15

Рукоятку окуляра вращают до совпадения визирной линии с линией раздела светлой и темной частей поля. При правильной установке прибора на нуль линия раздела света и тени при 20 ° С должна соответствовать нулевому делению шкалы массовой доли сухих веществ сахарозы в процентах.

На сухую поверхность измерительной призмы глазной пипеткой наносят 3– 4 капли осветленного сусла, закрывают камеру и проводят определение.

После каждого определения призмы промывают дистиллированной водой и вытирают досуха мягкой тканью. Затем проводят второе определение.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов параллельных определений двух проб, абсолютное расхождение между которыми не должно превышать 0,5 %. Результат округляют до первого десятичного знака.

3.2. Определение активной кислотности

Активную кислотность измеряют с помощью pH-метра по методике, изложенной в паспорте, прилагаемом к прибору. Правильность работы рН-метра проверяют по буферным растворам.

3.3. Определение титруемой кислотности

Кислотность – это показатель, характеризующий общее количество титруемых кислот в сусле спиртового производства, выраженный в кубических сантиметрах гидроксида натрия концентрацией 1 моль/дм3, пошедшего на титрование 20 см3 сусла [8].

Отмеривают пипеткой 20 см3 сусла, вносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют мерным цилиндром 100 см3 дистиллированной воды и капельницей 3– 4 капли раствора фенолфталеина. Содержимое колбы титруют из бюретки 0,1 М раствором гидроксида натрия до появления слабой розовой окраски, которая должна сохраняться не менее 30 с. Если окраска исчезает раньше, процесс титрования продолжают.

16

Кислотность (X) в см3 раствора гидроксида натрия концентрацией 1 моль/дм3 на 20 см3 сусла вычисляют по формуле:

X = V × К , 10

где V – объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование, см3;

К – коэффициент поправки рабочего раствора гидроксида натрия, определяемый по ГОСТ 25794.1-83.

Вычисление проводят до второго десятичного знака. За результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Получаемые результаты

Полученные данные записывают, сравнивают показатели качества сусла, полученного из различных видов зерна и с применением различных видов ферментных препаратов.

Содержание отчета

Студентам необходимо оформить отчет с указанием цели работы, основных теоретических положений, а также описанием последовательности выполнения работы, полученных результатов и выводов.

Контрольные вопросы

1.Перечислите основные виды сырья, применяемые для производства спирта в нашей стране.

2.Какие технологические операции включает в себя производство спирта?

3.Каким образом можно достичь осахаривания крахмалсодержащего сырья?

4.Какие ферментные препараты применяют в спиртовом производстве?

5.Перечислите основные показатели качества сусла спиртового производства.

17

Лабораторная работа № 2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

В ПИВОВАРЕНИИ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Основу технологических процессов производства пива составляют биохимические превращения сырья, происходящие под влиянием ферментов, и физико-химические процессы взаимодействия составляющих компонентов рецептуры напитка под влиянием условий внешней среды.

Основным сырьем для пивоварения служат ячменный солод, хмель, вода и дрожжи. Однако в последние годы всё большее применение находят несоложеные материалы: ячмень, кукуруза, рис, пшеница, сорго и др. Они позволяют значительно снизить себестоимость продукции и получать напитки с новыми органолептическими свойствами. При производстве массовых сортов пива используют до 60 % несоложеных материалов [10].

Основные процессы, протекающие при производстве пива, катализируют нативные ферменты ячменного солода и дрожжей. В солоде присутствуют все необходимые ферменты, разлагающие наиболее важные для пивоварения соединения – крахмал, β-глюканы, пентозаны, липиды и белки.

Если же при пивоварении используют низкокачественный солод или несоложеное сырье (более 15 % от массы засыпи), то необходимо применять промышленно выпускаемые ферменты, улучшающие качество готового пива [12].

Технологический процесс производства пива включает следующие стадии:

–очистка и дробление зернового сырья;

–получение пивного сусла;

–брожение, дображивание и осветление пивного сусла;

–фильтрация и розлив пива.

18

Стадия фильтрации может отсутствовать в случае приготовления нефильтрованных сортов пива. При необходимости пиво дополнительно насыщают диоксидом углерода. Для продления сроков хранения пиво часто подвергают пастеризации [10].

Бо<льшаячасть ферментативных реакций протекает на стадии затирания дробленого зернового сырья. Целью этой стадии является получение максимально возможного выхода качественного экстракта. Экстрагирование происходит под действием эндогенных и экзогенных ферментов, эффективность которых зависит от соотношения массы зерна и жидкости, значения рН, концентрации солей, продолжительности и температуры затирания.

При затирании протекают четыре основные ферментативные реакции:

−гидролиз белков до пептидов и свободных аминокислот;

−распад β-глюкановых цепей;

−гидролиз пентозанов до арабинозы и ксилозы;

−разложение клейстеризованного крахмала на сбраживаемые углеводы.

Эти превращения происходят под действием соответственно протеолитических, глюканолитических, пентозанолитических и амилолитических ферментов. Затирание обычно проводят последовательно с несколькими паузами при определенной температуре. Это делается в целях обеспечения оптимальных температурных условий для каждой группы ферментов. Первую паузу делают при 50 ° С для гидролиза бел-

ков, β-глюканов и пентозанов; вторую (при 63 ° С) – для действия β- амилазы, третью (при 70 ° С) – для действия α-амилазы. Последующее нагревание до 78 ° С проводят для инактивации ферментов.

Использование высокой доли несоложеного сырья в засыпи приводит к снижению выхода экстракта, α-аминного азота, ухудшению сбраживаемости, увеличению вязкости сусла и концентрации β- глюканов. Поэтому необходимо увеличивать концентрацию ферментов за счет внесения ферментных препаратов.

19

Добавление нейтральной бактериальной протеазы из Bacillus subtilis позволяет увеличить общую концентрацию растворимого азота, содержание свободного аминного азота, количество экстракта и улучшить цвет сусла.

Внесение β-глюканазы, ксиланазы и целлюлазы из Bacillus, Aspergillus, Penicillium или Trichoderma улучшает фильтруемость затора.

Для разложения клейстеризованного крахмала и высокомолекулярных декстринов широко используют термолабильную α-амилазу из Bacillus subtilis. Альтернативой ей является термостабильная бактериальная α-амилаза из Bacillus licheniformis, которая инактивируется лишь при температурах, близких к 100 ° С. Она гидролизует крахмал, набухающий и клейстеризующийся при высокой температуре. Для полного превращения крахмала и обеспечения максимального выхода экстракта необходимо использовать оптимальную комбинацию термостабильной α-амилазы из B. Licheniformis и экзгенной α-

амилазы из B. subtilis [12].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Цель работы – приготовление пивного сусла с использованием несоложеного сырья и ферментных препаратов, изучение влияния ферментных препаратов на эффективность процесса затирания и качество неохмеленного сусла.

Материалы, оборудование, реактивы:

−мельница лабораторная;

−весы технические;

−электроплитка;

−водяная баня;

−термометр технический с диапазоном измерения температур

0–100 ° С;

−ареометр-сахаромер АСТ-2 (10–20 %);

−цилиндр для ареометра;

−pH-метр;

−стаканы вместимостью 50 см3;

20