Биохимические основы неинфекционных патологических процессов. Лабораторный практикум

смешивают с 1 частью 0,6 г/100 мл раствора ванилина). Хлороформ. Основной (12,0 г/л) стандартный раствор триолеина (взвешивают 1200 мг триолеина, переносят в колбу (100 мл) и доводят объем хлороформом до метки)

Ход определения

Опытная проба. К 0,05 мл сыворотки приливают 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают и отправляют на 10 мин в кипящую водяную баню. После вынимают и охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры. Из пробирки отбирают 0,2 мл смеси, которую переносят в другую пробирку, содержащую 3 мл фосфорнованилиновой смеси. После перемешивания пробы выстаивают 45 мин в темноте при комнатной температуре. Экстинкцию определяют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны от 500 до 560 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки используют 0,05 мл воды. Расчет ведут по калибровочному графику или по формуле (норма - 4,0-8,0 г/л). Для получения данных на построение калибровочного графика из основного раствора готовят рабочие стандартные растворы (таблица 13).

Таблица 13 - Данные к построению калибровочного графика для определения общих липидов в сыворотке крови

Из каждого разведения набирают по 0,05 мл рабочего стандартного раствора и далее пробы обрабатывают так же, как опытные. Пользуясь найденными данными,

строят калибровочный график. Прямая зависимость между содержанием общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 12 г/л.

Расчет по формуле:

общие липиды (г/л) = Е0п./Ест.*Сст., где Е -экстинкция опытных и стандартных проб;

С - концентрация основного стандартного раствора (12,0 г/л).

Как физиологическое явление увеличение содержания липидов в крови

(гиперлипемия) наступает через 1-4 ч после принятия обследуемым пищи. Оно выражено тем сильнее, чем ниже уровень липидов в крови натощак.

Для разделения общих липидов на составляющие их компоненты весьма удобно использование методов тонкослойной хроматографии. Однако необходимость в приготовлении пластин с тонким слоем силикагеля и сложность учета выделяемых фракций сдерживают их широкое применение в клинико-

диагностических лабораториях. Поэтому для определения фракций липидов большое распространение получили различные химические методы.

Из всех компонентов липидного спектра сыворотки крови наибольший интерес представляет исследование содержания общего холестерина и его эстерифицированной формы.

5.2Определение содержания холестерина

5.2.1Унифицированный метод по реакции с уксусным ангидридом

(метод Илька).

Принцип

В плазме и сыворотке крови содержатся холестерин и его эфиры, которые при обработке смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной кислот приобретают окраску.

72

Реактивы

Ледяная уксусная кислота. Концентрированная серная кислота. Уксусный ангидрид. Абсолютный этиловый спирт. Кислотная смесь (в сухую колбу вносят 10

мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты).

Калибровочный раствор (232 мг холестерина растворяют в 3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л).

Ход определения

К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки приливают 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, смешивают и ставят на 20 мин в термостат при 37 °С, затем производят фотометрирование в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм. Построение калибровочной кривой и расчет. К 0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при 37°С, так же, как и опытные пробы, затем фотометрируют.

Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л, пробы, в

которую взято 0,1 мл — содержанию 6 ммоль/л и т. д.

5.2.2 Унифицированный метод по реакции с хлорным железом (метод

Златкис—Зака).

Принцип

Хлорное железо в присутствии уксусной, серной и фосфорной кислот окисляет в плазме крови свободный и эфирносвязанный холестерин с образованием ненасыщенного комплекса красно-фиолетового цвет. При этом фосфорная кислота увеличивает стойкость реактива, содержащего хлорное железо.

73

Реактивы

Ледяная уксусная кислота. Серная кислота, концентрированная. Железо хлорное FеСl3-6Н2О. Ортофосфорная кислота 85 %. Раствор хлорного железа (2,5 г

хлорного железа растворяют в 80 мл ортофосфорной кислоты, нагревая до полного растворения препарата, после охлаждают и доводят объем до 100 мл ортофосфорной кислотой). Цветной реактив (4 мл раствора хлорного железа приливают серную кислоту так, чтобы суммарный объем был 50 мл). Калибровочный раствор холестерина в уксусной кислоте 3 ммоль/л (116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты).

Ход определения

К 1,3мл CH3COOH осторожно приливают 0,05 мл плазмы или сыворотки без гемолиза, перемешивают, а затем вносят 1 мл цветного реактива, хорошо встряхивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта, в который берут 1,3 мл уксусной кислоты, 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы и 1 мл концентрированной серной кислоты. Для приготовления калибровочного графика вместо исследуемого материала берут 0,2 мл калибровочного раствора, к которому добавляют уксусную кислоту до суммарного объема 1,35 мл, а затем приливают 1 мл цветного реактива. Проба, в

которой 0,05 мл калибровочного реактива, по окраске соответствует опытной пробе с содержанием холестерина в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба, в которой 0,1

мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина 6 ммоль/л и т.

д. Расчет выполняют по калибровочному графику.

5.2.3 Унифицированный метод по реакции с хлорным железом после экстракции изопропанолом.

Принцип

74

Из плазмы крови экстрагирование холестерина и его эфиров производят изопропанолом. Для определения уровня холестерина его окисляют хлорным

промывается ацетоном и содержание холестерина определяется по той же цветной

ледяная. Ортофосфорная кислота. Серная кислота, концентрированная. Железо хлорное, раствор в фосфорной кислоте (2,5 г FeCl3-6H2O растворяют при нагревании примерно в 80 мл ортофосфорной кислоты, объем доводят ортофосфорной кислотой до 100мл). Цветной реактив (4 мл раствора хлорного железа добавляют серную кислоту до суммарного объема 50 мл). Дигитонин 1 % (1 г дигитонина растворяют в

50 мл этилового спирта, приливают 50 мл воды и через время, после охлаждения,

фильтруют). Ацетон. Калибровочный раствор (38,7 мг холестерина растворяют в 100

мл изопропанола, получают раствор, содержащий 1 ммоль/л; его разводят в 5 раз изопропанолом, получая раствор, содержащий 200 мкмоль/л).

Ход определения

К 0,2 мл плазмы или сыворотки постоянно встряхивая приливают 4,8 мл изопропанола, перемешивают и спустя 10 мин центрифугируют 5 мин, отсасывают пипеткой надосадочную жидкость (экстракт); 1 мл экстракта берут для определения общего холестерина, а 2 мл — для определения свободного холестерина. Для определения общего холестерина к 1 мл экстракта добавляют 2 мл уксусной кислоты,

перемешивают, а затем вносят 2 мл цветного реактива, опять перемешивают и выдерживают от 10 до 15 мин. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути

0,5 см при длине волны 560 нм против холостой пробы, в которой вместо экстракта плазмы 1 мл изопропанола. Для определения свободного холестерина к 2 мл экстракта приливают 1 мл раствора дигитонина, закрывают пробкой и оставляют на

30 мин, после чего 10 мин центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, к

75

осадку добавляют 3 мл ацетона, перемешивают и вновь центрифугируют 5 мин.

Надосадочную жидкость удаляют и оставляют пробирки открытыми на несколько минут для испарения остатков ацетона. К сухому осадку приливают 1 мл изопропанола и 2 мл уксусной кислоты, перемешивают и затем добавляют 2 мл цветного реактива, при этом осадок должен полностью раствориться. Через 15 мин фотометрируют при длине волны 560 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5

см против холостой пробы, в которую берут 1 мл изопропанола, 2 мл уксусной кислоты и 2 мл цветного реактива. Для калибровки к 1 мл калибровочного раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл цветного реактива и через 10—15

мин фотометрируют в таких же условиях, как и опытные пробы. При расчете количества общего холестерина калибровочная проба соответствует содержанию 5

ммоль/л холестерина, а при расчете содержания свободного холестерина — 2,5

ммоль/л.

Нормальные величины

Содержание общего холестерина: от 3,9 до 6,5 ммоль/л (от 150 до 250 мг в 100

мл), из них 70 % этерифицированный, а 30 % свободный.

Клиническое значение.

Увеличение уровня холестерина говорит об угрозе развития атеросклероза;

чаще всего холестерин повышен при II типе гиперлипопротеидемии, увеличивается он также при диабете и нефритах. Снижение уровня холестерина чаще всего бывает при гипертиреоидизме.

5.3 Определение содержания б-липопротеидов

Принцип

Определяют после осаждения в-липопротеидов гепарином в присутствии солей марганца. Липопротеиды, которые обладают электрофоретической подвижностью,

осаждают гепарином в присутствии солей марганца и удаляют центрифугированием, при этом хиломикроны всплывают, образуя пленку. Только а-

липопротеиды остаются в растворе, в которых определяется содержание холестерина.

76

Реактивы

Марганца хлористого 1 моль/л (39,6 г МnСl2-4Н2О растворяют в воде и объем доводят в колбе до 200 мл). Гепарин 5000 ЕД в 1 мл.

Ход определения

Устанавливают пробирку в штатив на ледяной бане, затем в нее вносят 1 мл исследуемой плазмы или сыворотки и 0,04 мл препарата гепарина, перемешивают,

после чего приливают 0,04 мл 1 М раствора марганца хлорида, снова перемешивают и выстаивают на льду 30 мин. Центрифугируют 30 мин при 2500 об/мин при температуре от 4 до 6 °С. Осторожно вынимают пробирки из центрифуги, исключая поднятия осадка. В нижнем слое находятся осажденные в-липопротеиды, в верхнем

— растворенные а-липопротеиды, над которым может быть кольцо хиломикронов.

Пипеткой с тонким носиком отсасывается верхний слой, для определения холестерина любым из описанных выше методов. Если сыворотка хилезная, сверху может быть большой слой хиломикронов, из-под которого трудно взять пробу. Тогда рекомендуют повторить определение, взяв несколько мл сыворотки и соответственно увеличив другие реактивы, при этом прозрачный слой оказывается больше и из него легче взять пробу. Калибровку проводят аналогично, как и в методе определения холестерина, но разница в том, что содержание холестерина а-липопротеидов значительно ниже, чем общего, поэтому калибровочный раствор должен соответствовать содержанию от 1 до 2 ммоля холестерина в 1 л. Нормальные величины: от 0,9 до 1,9 ммоль/л.

Клиническое значение

Содержание холестерина а-липопротеидов в крови здоровых людей незначительно изменяется с возрастом и как правило значение не колеблется вследствие различных других причин. Если значение ниже 0,9 ммоль/л, то говорят о нарушении липидного обмена и высоком риске развития атеросклероза.

Увеличение концентрации холестерина а-липопротеидов, как и повышение общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.

77

5.4 Определение содержания триглицеридов

Триглицериды – это сложные эфиры глицерина и трех остатков жирных кислот,

обычно с 16 или 18 атомами углерода. Состав жирнокислотных остатков зависит в основном от питания и находится в определенных пределах. Исходя из этого,

триглицерид представляет собой не индивидуальное химическое вещество, а группа родственных соединений.

5.4.1 Унифицированный метод по реакции с ацетилацетоном после

экстракции смесью гептана и изопропилового спирта.

Принцип

Экстрагирование триглицеридов производят смесью гептана и изопропилового спирта, в нее переходят исключительно неполярные липиды, а

полярные фосфолипиды остаются в водной фазе. Триглицериды гидролизуются щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который обнаруживается по цветной реакции с ацетилацетоном.

Реактивы

Гептан. Изопропиловый спирт. 0,08 н. серная кислота (2,2 мл концентрированной H2SO4 на 1 л воды). Едкий калий, 6,25 моль/л (7,8 г KOH

осторожно растворить в 50 мл воды). Уксусная кислота, 5 %. Йодная кислота (0,6 г

HIO4-2H2O (перйодная кислота) в 100 мл 5 % уксусной кислоты). Аммония ацетат 2

моль/л (154 г ацетата аммония во воде, доводя объём до 1 л). Ацетилацетоновый реактив (1,5 мл ацетилацетона (СН3СОСН2СОСН3) развести раствором уксуснокислого аммония до объема 200 мл). Калибровочный раствор триолеина, 2

ммоль/л (170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта).

Ход определения

78

К 0,5 мл анализируемой сыворотки или плазмы приливают 2 мл гептана, 3,5

мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н. серной кислоты, перемешивают и спустя 5

мин центрифугируют. Из верхнего слоя отбирают 0,4 мл, вносят 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н. КОН.

Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане 10 мин при

70 °С. Затем охлаждают, добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, после перемешивания снова закрывают пробкой и нагревают еще 10 мин при 70 °С.

Происходит окрашивание в желто-зеленый цвет, интенсивность которого измеряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды; развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.

Расчет проводят согласно правилам пропорций или согласно калибровочному графику.

Нормальные величины

От 0,55 до 1,65 ммоль/л, но, так же, как и для холестерина, верхняя граница нормальных величин у мужчин зависит от возраста, особенностей жизни и т. д.

Клиническое значение

Определение уровня триглицеридов имеет важное диагностическое значение для типирования эссенциальных гиперлипидемий, в частности дифференцирования типа ПА (изолированная гиперхолестеринсмия) и ПБ (увеличение содержания и холестерина, и триглицеридов). Увеличение уровня триглицеридов регистрируется при нефротическом синдроме, переломах костей, гипотиреозе и алкоголизме, но важного диагностического значения при данных заболеваниях не имеет. Но в практическом плане необходимо всегда помнить о существовании алиментарной гипертриглицеридемии.

79

Оформить результаты. Вывод.

Контрольные вопросы:

1.В чем заключается метод Илька?

2.Перечислить фракции холестерина?

3.В чем заключается метод Златкис - Зака?

4.Назовите биохимические функции липидов?

5.Какова сущность метода определения триглицеридов в крови?

6.Перечислить причины атеросклероза?

80