Биохимические основы неинфекционных патологических процессов. Лабораторный практикум

0,5 – концентрация мочевины в стандартном растворе, ммоль/л;

10 – коэффициент разведения.

Клиническое значение

Отклонения от нормального содержания мочевины в сыворотке крови проявляются в зависимости от скорости процессов синтеза мочевины и ее выделения.

Более высокие значения мочевины в сыворотке крови могут говорить о следующем:

нарушения функции почек (острые и хронические заболевания, обтурация мочевых путей), нарушения почечной перфузии, истощения запасов воды в организме (рвота,

обезвоживание, понос), при усиленном распаде белков (острая желтая атрофия печени, тяжелые заболевания, острый инфаркт миокарда, ожоги, стресс). Снижение уровня мочевины в сыворотке крови может наблюдаться при заболеваниях печени сопровождающихся нарушением синтеза мочевины (паренхиматозная желтуха,

цирроз печени), при повышенной утилизации белка в тканях.

2.3 Определения содержания креатинина

Синтез эндогенного креатинина происходит с участием таких аминокислот — аргинина, глицина, метионина. В процессе фосфорилирования креатин трансформируется в креатинфосфат, из последующего формируется креатинин

(ангидрид креатина). Данный процесс необратим в живом организме.

Креатин + АТФ креатинкиназа креатинфосфат + АДФ Креатинфосфат креатинин + неорганический фосфат

Креатин и креатинфосфатважные азотистые соединения мышц, участвующие в химических процессах, которые лежат в основе мышечных сокращений. В

сыворотке крови содержится в основном креатинин. Суточное выделение креатинина для каждого человека —величина относительно постоянная, которая зависит в основном от массы мышечной ткани и незначительно зависит в отличие от мочевины от питания. С возрастом содержания креатинина в сыворотке крови уменьшается.

21

Принцип

В щелочной среде креатинин с пикриновой кислотой образуют окрашенный комплекс.

Реактивы

Пикриновая кислота (2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл воды после этого нагревают на горячей водяной бане; раствору необходимо постоять 24 ч;

обязательна фильтрация). НСl, 0,1 моль/л. Основной стандартный раствор креатинина, 10 ммоль/л (113,1 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором НСl). Рабочий стандартный раствор, 0,1 ммоль/мл (развести основной раствор водой

в100 раз). Гидроксид натрия, 2,5 моль/л.

Ход работы

Смешиваем 2 мл сыворотки с 6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты.

Через 5 мин пробирку со смесью помещают в кипящую водяную баню, на 20 сек.,

после центрифугируют. Затем 4 мл центрифугата смешивают с 0,2 мл 2,5 моль/л

раствора едкого натра. Иногда в результате подщелачивания раствор мутнеет

(выпадения фосфатов). Поэтому если раствор мутный, еще раз центрифугируют.

Затем приливают воду, доводя раствор до объема 10 мл. Измерение в кювете с толщиной слоя в 20 мм, длина волны от 500 до 560 нм (зеленый светофильтр) против контрольной пробы (3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5

моль/л раствора едкого натра доводят до объема 10 мл водой).

Расчет по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего стандартного раствора креатинина готовят разведения, как указано в таблице 2.

Таблица 2 Данные для построения калибровочного графика

По истечению 10 мин производят измерения при тех же условиях, что и опытные пробы. Калибровочная кривая линейна до 260 мкмоль/л креатинина.

Определение уровня креатинина в моче

Смешать 0,5 мл мочи (из суточного количества) с 3 мл раствора пикриновой кислоты в мерной колбе (V - 100 мл). Хорошо встряхнуть и прилить 0,2 мл 2,5 моль/л

раствора едкого натра. Оставить на 10 мин в покое. После этого добавить воды до 100

мл. Измерения проводят на фотометре в кювете с толщиной слоя в 1 см, длина волны от 500 до 560 нм (зеленый светофильтр) против контрольной пробы (3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра доводят водой до объема 100 мл).

Расчет производят по формуле при сравнении с стандартной пробой.

Состав стандартной пробы: к 0,5 мл основного стандартного раствора добавляют 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы обрабатывают так же, как опытные.

К = Сст Еоп а, Ек б

где К — количество креатинина в суточной моче, мкмоль;

С ст — количество креатинина в стандартной пробе, 50 мкмоль;

Е оп — экстинкция опытной пробы;

23

Ест— экстинкция стандартной пробы;

а — суточное количество мочи;

б — количество мочи, взятой для анализа.

Клинико-диагностическое значение.

Повышение уровня креатинина в сыворотке связано с острым и хроническим нарушением функции почек различного генеза, закупоркой мочевых путей, кишечной непроходимостью, выявляется при заболеваниях печени, голодании, кроме этого при акромегалии и гипертиреозе. Гипокреатининемия в сыворотке наблюдается при снижении мышечной массы, во время беременности.

Определение уровня креатинина достаточно чувствительный тест, так как повышение его в крови происходит гораздо раньше, чем повышение концентрации мочевины.

Креатинин в моче исследуют главным образом для учета экскреции многих физиологически значимых соединений.

2.4 Определение клиренса креатинина (проба Реберга − Тареева)

С помощью пробы Реберга − Тареева судят о клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции в почках.

Проба основана на том, что креатинин фильтруется клубочками, не всасывается и секретируется канальцами в небольшом количестве. Проведение пробы заключается в следующем: больной утром мочится, выпивает 200 мл воды и затем натощак в состоянии полного покоя собирает мочу за точно определённое время (2

ч). Посередине этого периода времени берут кровь из вены. Измеряют концентрацию креатинина в крови и моче, собранной за 2 ч. Рассчитывают коэффициент очищения

(Коч.) или клиренс эндогенного креатинина:

К оч.=(М/Пл) × Д (мл/мин),

где М — концентрация креатинина в моче;

24

Пл. — концентрация креатинина в плазме;

Д — минутный диурез в мл/мин (равен количеству мочи, выделенной за 2 ч (мл), делённому на 120 мин).

Коч. выражает скорость клубочковой фильтрации (СКФ). Для определения СКФ можно исследовать мочу, собранную за сутки.

Норма СКФ у мужчин: 120 ± 25 мл/мин; у женщин: 95 ± 20 мл/мин. Величины СКФ низки утром, увеличиваются до максимального уровня в дневные часы, и затем вечером уменьшаются.

У здоровых людей снижение СКФ происходит под влиянием тяжёлой физической нагрузки и отрицательных эмоций; возрастает после питья жидкости и приёма высококалорийной пищи.

СКФ — это достаточно чувствительный показатель функционального состояния почек, её снижение представляет один из ранних симптомов нарушения функции почек. Уменьшение СКФ, как правило происходит раньше, чем снижение концентрационной функции почек и накопление в крови азотистых шлаков. При первичных клубочковых поражениях недостаточность концентрационной функции почек определяют при резком снижении СКФ (приблизительно на 45 %). При хронических пиелонефритах поражается в большей степени дистальный отдел канальцев, и фильтрация снижается позднее, чем концентрационная функция канальцев. Нарушение концентрационной функции почек и иногда даже незначительное повышение содержания в крови азотистых шлаков у больных с хроническим пиелонефритом возможно при отсутствии снижения СКФ.

Экстраренальные факторы влияют на СКФ. Таким образом, СКФ уменьшается при сердечной и сосудистой недостаточности, обильной диарее и рвоте, гипотиреозе,

механическом затруднении оттока мочи (опухоли предстательной железы),

поражении печени. В начальной стадии острого гломерулонефрита снижение СКФ происходит не только из-за нарушения проходимости клубочковой мембраны, но и в результате расстройств гемодинамики. При хроническом гломерулонефрите уменьшение СКФ вероятно связано с азотемической рвотой и диареей.

25

Стойкое падение СКФ до 40 мл/мин при хронической почечной патологии говорит о выраженной почечной недостаточности. Увеличение СКФ регистрируют при хроническом гломерулонефрите с нефротическим синдромом, в ранней стадии гипертонической болезни. Необходимо помнить, что при нефротическом синдроме значение клиренса эндогеного креатинина не всегда соответствует истинному состоянию СКФ.

Это связано с тем, что при нефротическом синдроме креатинин выделяется не только клубочками, но и секретируется изменённым канальцевым эпителием, и

поэтому Коч. эндогенного креатинина может до 30% превышать истинный объём клубочкового фильтрата.

Клиренс эндогенного креатинина можно определить по номограмме,

приведённой на рисунке 1.

Для этого необходимо знать массу тела больного (кг), возраст (лет) и

концентрацию креатинина в сыворотке крови (мг%). Прямой линией соединяют возраст пациента и его массу тела и отмечают точку на линии А.

После этого отмечают содержание креатинина в сыворотке крови на шкале и соединяют её прямой линией с точкой на линии А, продолжая её до пересечения со шкалой клиренса эндогенного креатинина. Точка пересечения прямой линии со шкалой клиренса эндогенного креатинина соответствует СКФ.

26

2.5 Определение мочевой кислоты в сыворотке крови

Мочевая кислота – это продукт разложения пуриновых нуклеозидов, входящие в состав нуклеиновых кислот, макроэргических соединений, и некоторых коферментов.

Из эндогенных нуклеотидов в организме человека образуется примерно 500 мг мочевой кислоты, из поступающих с пищей — примерно 200 мг.

Для определения уровня мочевой кислоты используют колориметрический и энзимативный методы.

Нормальные величины мочевой кислоты:

-мужчины — от 0,24 до 0,5 ммоль/л (от 4,0 до 8,5 мг/ 10-1 л);

-женщины — от 0,16 до 0,44 ммоль/л (от 2,8 до 7,5 мг/ 10-1 л).

Принцип

Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета.

Реактивы

Серная кислота, 0,35 моль/л (смешать100 мл воды с 5 мл концентрированной серной кислоты и довести объем водой до 250 мл). Натрий вольфрамовокислый двухводный (Na2WО4 X 2Н2О) 10 %. Натрия карбонат, 103 г/л (25,8 г натрия карбоната растворить в небольшом количестве воды и довести объем до 250 мл).

Ортофосфорная кислота 85 %-ная. Сульфат лития. Карбонат лития.

Фосфорновольфрамовый реактив (в круглодонную колбу (1,5 л) внести 40 г

вольфрамовокислого натрия и 300 мл воды, прилить 32 мл 85 %-ной ортофосфорной кислоты и несколько стеклянных бусинок; кипятить 2 часа на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником; охлаждить до комнатной температуры и долить водой до 1 л; добавить 32 г сульфата лития). Мочевая кислота.

Формалин, выше 37,5 %-ной концентрации. Основной стандартный раствор мочевой кислоты, 6 ммоль/л (растворить 0,6 г карбоната лития в 150 мл воды, профильтровать и нагревать до 60 °С; 1,017 г мочевой кислоты, внести в нагретую колбу (1 л) влить теплый раствор карбоната лития и быстро встряхнуть; колбу охладить и добавить 20

28

мл раствора формалина, 300 мл воды; внести 2 капли раствора метилового оранжевого, затем встряхнуть и медленно прилить 20 мл 0,35 моль/л серной кислоты до изменения цвета в розовый; долить колбу до метки водой (раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла; 1 мл раствора содержит 0,006

ммоль мочевой кислоты)). Рабочий стандартный раствор мочевой кислоты, 0,03

ммоль/литр (1 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл водой)

Материал для исследования

Сыворотка, свободная от гемолиза.

Ход работы

Опытная проба: к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл 0,35 моль/л

серной кислоты и перемешивают. Затем вносят 0,5 мл раствора вольфрамовокислого натрия и тщательно перемешивают. Через 10 минут фильтруют. К 3 мл фильтрата добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната, перемешивают. Затем приливают 1 мл фосфорновольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через

30 м измеряют в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны от 590 до 700 нм

(красный свето­фильтр) против контрольной пробы. Контрольную пробу ставят подобно опытной, но вместо фильтрата 3 мл воды.

Расчет ведут по формуле при сравнении с стандартной пробой. Стандартную пробу ставят и измеряют аналогично опытной, но вместо фильтрата берут 3 мл рабочего стандартного раствора.

Х = Еоп ∙ Ск ∙ 10,

Ек

где Х - концентрация мочевой кислоты, ммоль/литр:

E оп — экстинкция опытной пробы;

Е к — экстинкция калибровочной пробы;

С к — концентрация рабочего калибровочного раствора, 0,03 ммоль/литр;

10 — пересчет на объем сыворотки (в опытную пробу берут 0,3 миллилитра, то есть в 10 раз меньше, чем в калибровочную пробу)

29

Нормальные величины.

Мужчины: 0,24—0,50 ммоль/л, или 4,0—8,5 мг/100мл;

Женщины: 0,16—0,4 ммоль/л, или 2,8—7,5 мг/100мл.

Клиническое значение

Увеличение уровня мочевой кислоты в крови наблюдается при нарушении ее выведения из организма (заболевания почек, ацидоз, токсикоз беременности);

повышенном образовании пуринов (некоторые гематологические заболевания, прием пищи богатой пуринами).

2.6 Определение содержания белка в моче сульфосалициловым и

пирогалловым методами

Незначительное количество белка наблюдается в суточной моче и у здоровых лиц, но данные концентрации не регистрируют в разовых порциях используемыми методами. Определение в моче белков с относительно большой молекулярной массой говорит о нарушениях избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении.

2.6.1 Определение содержания белка в моче сульфосалициловым методом

Принцип метода основан на коагуляции белка в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты).

Реактив

20 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

Ход работы

К 3-4 мл профильтрованной мочи прибавляют по 4 – 6 капель реактива. При положительной пробе раствор мутнеет. Избыток сульфосалициловой кислоты может привести к растворению белка, проба из положительной становится отрицательной.

30