Биохимические основы неинфекционных патологических процессов. Лабораторный практикум

Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют

2—3 каплями 10 %-ного раствора СН3СООН.

2.6.2 Определение содержания белка в моче пирогаллоловым методом

Принцип метода

Белок в кислой среде с пирогаллоловым красным и молибдатом натрия образует соединение красного цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна количеству общего белка в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 600 нм.

Реактивы

Реагент: буферный раствор, рН 2,5, содержащий пирогаллоловый красный, 60

мкмоль/л; молибдат натрия, 40 мкмоль/л; оксалат натрия, 1,0 ммоль/л; янтарная кислота, 48 мМ и бензоат натрия, 3 ммоль/л – 1 флакон (100 мл) или 3 флакона (по

100 мл). Калибратор 1: калибровочный раствор белка, 200 мг/л, содержащий сывороточный человеческий альбумин, 70 %, глобулин, 30 %, хлористый натрий, 0,9 % и азид натрия, 0,095 % – 1 флакон (1,0 мл) или 1 флакон (3,0 мл). Калибратор 2:

калибровочный раствор белка, 1000 мг/л, содержащий сывороточный человеческий альбумин, 70 %, глобулин,30 %, хлористый натрий, 0,9 % и азид натрия, 0,095 % – 1

флакон (1,0 мл) или 1 флакон (3,0 мл). 0,9 % раствор NaCl (физиологический раствор)

Оборудование

Спектрофотометр

Ход работы

Компоненты реакционной смеси отбирать в количествах, указанных в

таблице 3.

31

Таблица 3 – Компоненты реакционной смеси

Пробы перемешать и оставить в покое при комнатной температуре на 5 минут.

Определить оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против контрольной (холостой) пробы в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 600 нм. Окраска растворов устойчива 30 минут при комнатной температуре.

При содержании общего белка в моче выше 2000 мг/л анализируемую пробу разводят физиологическим раствором, вновь повторяя анализ и полученный результат умножая на разведение. Содержание общего белка в пробе мочи (мг/л)

выявляют по формуле:

С = Еоп ∙ Скал Екал

где С — концентрация общего белка в анализируемой пробе, мг/л;

Еоп. — оптическая плотность анализируемой пробы, ед. опт. плотн.;

Екал. — оптическая плотность калибратора, ед. опт. плотн.;

Скал. — содержание общего белка в калибраторе, мг/л.

32

Клиническое значение. Определение содержания белка в моче необходимо при диагностике и лечении заболеваний почек, сердца, дисфункции щитовидной железы,

сопровождающиеся протеинурией или альбуминурией.

Оформить результаты. Вывод.

Контрольные вопросы:

1.Какие функции выполняют почки?

2.Каков принцип уреазного метода определения мочевины в сыворотке крови?

3.Что образуется в результате фосфорилирования креатина?

4.Какая проба позволяет определить клиренса креатинина?

5.Методы определения белка в моче?

6.Мочевая кислота является продуктом распада …. ?

7.Каков принцип метода определения креатинина по взаимодействию с пикриновой кислотой?

33

3 Лабораторная работа 3 Определение содержания кальция,

фосфора и меди в сыворотке крови. Белки плазмы крови

Цель занятия: Ознакомиться с методами определения белков плазмы крови.

Провести определение кальция, фосфора и меди в сыворотке крови.

3.1 Определение содержания кальция в сыворотке и плазме крови

Кальций сыворотки крови имеет 3 формы 1) свободный ионизированный кальций; 2) связанный с белками, не диффундирующий; 3) кальций недиссоциированный, но способный к диффузии через полупроницаемые мембраны.

Эритроциты содержат - 0,5 ммоль/л Са, лейкоциты - 2,5 ммоль/л, сыворотка - 4,5-6,0 ммоль/л, цельная кровь - 2,5-3,5 ммоль/л. Диагностическое значение имеет определение кальция только в плазме (сыворотке), где его концентрация постоянна.

Химические методы определения общего кальция в сыворотке крови подразделяются на 2 группы: прямые и непрямые, состоящие в предварительном осаждении кальция в форме труднорастворимых в воде соединений.

3.1.1 Определение общего кальция в сыворотке крови фотометрическим

методом, основанным на реакции с глиоксальбис-2-оксианилом

Принцип метода

Глиоксаль-бис-2-оксианил (ГБОА) с Са в щелочной среде формирует окрашенное соединение красного цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации кальция.

Реактивы

0,4 н раствор NaOH. Метанол. 3 Раствор ГБОА в метаноле - 0.1 %. Эталонный

(стандартный) раствор Са - 100 мг/л, или 2,50 ммоль/л (0,125 г. СаСО3 растворяют,

34

нагревая в 30-40 мл 0,1 н раствора HCI; охлаждают, переносят в колбу (500 мл) и

доводят объем до метки водой.

Ход работы

В пробирку вносят 1 мл дистиллированной воды, 0,02 мл свежей сыворотки и приливают 2 мл раствора ГБОА. Перемешивают и выстаивают 30 мин при комнатной температуре. Затем приливают 0,5 мл раствора едкого натра и вновь перемешивают.

Одновременно ставят контрольную пробу и пробу со стандартным раствором (0,02

мл его проводят через все этапы методики). Измерение осуществляют между 5 и 15

минут с момента добавления щелочи. Экстинкцию опытного и стандартного растворов определяют по отношению к дистиллированной воде (или контрольной пробе) на фотоэлектроколориметре (ФЭК) с зеленым светофильтром (длина волны

540 нм) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Результаты оценивают по формуле:

где 2,50 - показатель концентрации стандартного раствора кальция в ммоль/л (10 мг/100 мл).

Расчет производят и по калибровочной кривой, построенной для интервала концентраций от 0,25 до 3,00 ммоль/л ( от 1 до 12 мг/ 100 мл).

3.1.2 Определение общего кальция в сыворотке и плазме крови по цветной

реакции с крезолфталеинкомплексоном

Принцип

Крезолфталеинкомплексон (о-КФК) связывается с Са в щелочной среде с формированием красно-фиолетового комплекса, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации Са. В эту смесь добавляют 8-оксихинолин. Данный реактив связывает металлы, мешающие определению, но образует с кальцием менее прочный комплекс, чем крезолфталеинкомплексон.

35

Реактивы

Калий-боратный буфер (в колбе (500 мл) к 150 мл дистиллированной воды добавляют 100 г борной кислоты, доливают 290 мл 5 н едкого калия и растворяют при

+ 56° С, объем доводят до 500 мл дистиллированной водой). Глициновый буфер - 2

моль/л (в колбу (50 мл) вносят 7,5 г глицина, затем 40 мл дистиллированной воды и доливают объем до метки и добавляют 2 капли хлороформа). Раствор 8-оксихинолина

(оксина) в абсолютном спирте – 1 %. Оксиновый буфер (в колбу (500 мл) вливают

12,5 мл калий-боратного буфера, 5 мл глицинового буфера, 300 мл дистиллированной воды; 5 н едким кали доводят рН раствора до 10,6, добавляют 50 мл 1 г/100 мл раствора 8-оксихинолнна и доводят объем до метки дистиллированной водой).

Рабочий крезолфталеиновый раствор (10 мг о-КФК в 100 мл оксинового буфера).

Основной калибровочный раствор (0,2497 г высушенного углекислого кальция в 5 мл

1 н соляной кислоты в колбе (100 мл), доливают объем до метки дистиллированной водой, накапывают несколько капель хлороформа. 1 мл раствора содержит 1 мг кальция (100 мг/100 мл раствора)). Из него готовят рабочие калибровочные

(стандартные) растворы, содержащие по 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0 мг кальция в 100 мл и по 3 мг магния. Для этого к 5-15 мл основного калибровочного раствора добавляют по 1 мл раствора, содержащего 3 мг магния в 1 мл (2,5 г MgCI2 • 6Н2О растворяют в дистиллированной воде в колбе (100 мл)), доводят объем водой до 100 мл и доливают еще несколько капель хлороформа.

Ход работы

В пробирку с 3 мл рабочего раствора вливают 0,05 мл сыворотки,

перемешивают. Спустя 5 мин определяют оптическую плотность раствора на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны от 500 до 560 нм) в кювете с толщиной слоя 5

мм. Результаты сопоставляют с аналогичными данными контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов после добавления сыворотки. Одновременно с опытной пробой ставят стандартную. В контрольную пробу вместо сыворотки вносят дистиллированную воду. Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в

раствор соли кальция, поэтому следуют лабораторную посуду перед экспериментом

36

прокипятить в соляной кислоте. Определение проводить в сыворотке или в плазме,

полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислота и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут нарушить ход определения.

3.2 Определение содержания фосфора в сыворотке крови

Кроме неорганического фосфора, концентрация которого в плазме и эритроцитах практически равна, в крови имеется фракции кислоторастворимого фосфора и липидного фосфора. Кислотрастворимый фосфор в клетках, липидный в эритроцитах, и в плазме.

3.2.1 Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению

фосфорно-молибденовой гетерополикислоты

Принцип метода

Трихлоруксусной кислотой (ТХУ) производят осаждение белков, в кислой среде фосфорная кислота с молибденовой кислотой формируют фосфорно-

молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.

Реактивы

ТХУ 10 %. Кислота серная 5 н. Аммоний молибденовокислый, 5 % (5 г

молибденовокислого аммония в 100 мл 5 н серной кислоты). Натрий кислый сернистокислый NaHSО3. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия

Na2SО3. Эйконоген (6 г бисульфита натрия растворяют в 25 мл воды, вносят 0,1 г

эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют). Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 литр,

готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120

37

°С однозамещенного фосфата калия КН2РО4 в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1; 2 и 3 ммоль/литр. Для этого 1; 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.

Ход работы

К 1 мл приливают 4 мл воды и 5 мл раствора ТХУ, через 10 минут центрифугируют. К 5 мл безбелкового фильтрата вносят 1 мл раствора молибденово-

кислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Спустя 20 минут фотометрируют при длине волны от 630 до 690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы. Одновременно ставят холостую пробу, в которой вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные пробы, в них вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.

Расчет производят по калибровочному графику или правилу пропорций.

3.2.2 Метод определения фосфора по образованию окрашенного комплекса

малахитового зеленого с фосфорномолибденовой кислотой

Принцип метода

Неорганический фосфор с молибденовой кислотой формируют фосфорномолибденовую гетерополикислоту, которая, в реакции с основным красителем — малахитовым зеленым, дает яркое зеленовато-синее окрашивание.

Если фосфора нет, то малахитовый зеленый в кислой среде окрашен в желто-

коричневый цвет.

Реактивы

Малахитовый зеленый. Аммоний молибденовокислый. Цветной реактив (1,5 г

малахитового зеленого в 250 мл воды, одновременно растворяют 10,3 г

молибденовокислого аммония в 250 мл 5 н НСl; растворы смешивают, оставляют в покое, затем фильтруют, за это время цвет реактива меняется). Твин 20, (1,5%-ный раствор — 0,15 мл твина 20 растворяют 10 мл воды). Калибровочный раствор.

Основной калибровочный раствор 50 ммоль/л, растворяют 702,2 мг однозамещенного

38

кислого фосфата калия КН2РО4, высушенного при температуре 120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

Ход исследования

0,02 мл сыворотки вносят в 1,5 мл воды, 2 мл цветного реактива и 1 каплю

1,5%-ного раствора твина. Через 15 мин фотометрируют при длине волны от 600 до

650 нм против холостого опыта, который ставят аналогично основному, но без сыворотки.

Для построения калибровочного графика необходимо 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного раствора, т.е. 10; 20 и 30 нмоль фосфора, доводят объем до 1,5 мл,

добавляют цветной реактив и раствор твина так же, как в основном опыте.

Калибровочная проба, в которую взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответствует опытной пробе, у которой взята сыворотка, содержащая фосфор в концентрации 1 ммоль/л.

Калибровочные пробы, в которые взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сывороткам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора в 1 л. По этим данным строится калибровочная кривая, которая и используется для расчета.

Нормальные величины

В сыворотке или плазме содержится 1—2 ммоль/л (3—6 мг в 100мл)

неорганического фосфора.

Клиническое значение

Увеличение неорганического фосфора происходит при почечной недостаточности, гипопаратиреоидизме, передозировке витамина D, снижение при нарушении кишечного всасывания, рахите, почечных тубулопатиях,

гиперпаратиреоидизме.

39

3.3 Определение содержания меди в сыворотки крови методом Шмидта в

модификации А.Г. Рахманкулова и И.А. Коптевой

Принцип метода. Содержание меди в сыворотки крови определяют по интенсивности желтой окраски, в следствии взаимодействия меди с комплексообразователем – диэтилдитиокарбаматом натрия.

Реактивы

Трихлоруксусная кислота (ТХУ) – 20 %. Пирофосфат натрия (Na2P2O7) – 4 %. NH4OH – 25 %. Диэтилдитиокарбамат натрия – 1 %.

Ход работы

В пробирку вносят 2 мл сыворотки, 5 мл бидистиллированной воды, 3 мл ТХУ,

перемешивают, через 10 мин производят центрифугирование 30 мин при 4000-5000

об/мин до прозрачного центрифугата. Отмеряют 5 мл надосадочной жидкости и приливают к ней 1 мл раствора пирофосфата натрия, 0,5 мл концентрированного раствора аммиака, 1 мл раствора диэтилдитиокарбамата, содержимое колбы встряхивают в течение 20 с. Желтый раствор колориметрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром в кювете с толщиной слоя 20 мм.

Одновременно ставят одну на всю серию опытных проб контрольную пробу, в ней вместо 2 мл сыворотки используют 2 мл воды.

Расчет по формуле или по калибровочной кривой. Для получения данных к построению графика 0,3928 г кристаллической сернокислой меди (CuSO4 ∙ 5H2O)

развести в 1 л бидистилированной воды, 1 мл такого раствора содержит 100 мкг меди.

Из основного готовят рабочий раствор (разбавлением водой 1:100) для расчета данных по формуле или серию разведений (в 125-50 раз) для построения калибровочной кривой. Содержание меди в полученных растворах в пределах от 0,8

до 2,0 мкг/мл (от 12,6 до 31,5 мкмоль/л)

40