Биохимические основы неинфекционных патологических процессов. Лабораторный практикум

-длительность метода по отношению к срокам установления диагноза;

-способ взятия материала (преимущество отдается неинвазивным методам исследования и микрометодам).

Технико-экономические критерии заключаются:

-в оценке расхода рабочего времени;

-стоимость реактивов, их доступности;

-влияние реактивов на здоровье лаборантов (токсичность);

-наличия и стоимости приборов, стоимости автоанализа.

1.3 Материал для исследований, правила взятия и хранения

биологического материала

Лабораторное исследование пациента включает в себя три фазы:

1 Предварительная - сбор и транспортировка биологического материала в

лабораторию;

2Аналитическая;

3Заключительная - сообщение результатов и их интерпретации

(постаналитическая фаза).

Предварительная фаза лабораторного исследования подразделяется на

следующие аспекты:

-направление на анализ;

-время сбора образцов;

-техника взятия проб;

-объем проб;

-упаковка и маркировка проб;

-техника безопасности при сборе и транспортировке биологических проб.

11

Время сбора образцов Лаборатория должна иметь полную готовность, т.к. очень часто необходимо

немедленное выполнение тестов после взятия пробы. Транспортировка образцов биологического материала должна осуществляться быстро. Для проведения некоторых биохимических тестов (например, для определения концентрации гормонов в крови) необходимо брать пробы в определенное время суток, для других

(например, для определения уровня глюкозы в крови) важно знать время сбора образцов. Образцы для микробиологических исследований следует выполнять перед назначением антибиотикотерапии, которая подавляет рост микроорганизмов в культуре.

Техника взятия проб

Взятие крови из вены. Для выполнения большинства биохимических тестов используется венозная кровь. Её получают, с помощью специальной техники -

венопункции. Венопункцию осуществляют с помощью шприца с иглой или специальной шприц-пробирки.

Взятие капиллярной крови. Под кожей по мельчайшим сосудам протекает капиллярная кровь. Для ее получения делают прокол пальца или пятки (как правило у младенцев) с помощью скальпеля-копья.

Взятие артериальной крови. Артериальная кровь необходима для единственного теста – анализ газов крови. Процедура сбора артериальной крови,

более опасная и болезненная, чем венопункция, поэтому иногда, сначала делают инъекцию местного анестетика. Обычно артериальную кровь берут из радиальной артерии запястья, бедренной артерии в области паха или из плечевой артерии в области плеча.

В шприце обязательно наличие примерно от 0,5 до 1 мл раствора гепарина натрия или лития (1000 ЕД/мл), чтобы предотвратить процесс свертывания крови.

Поэтому чаще всего используют специальные гепаринизированные шприцы для сбора артериальной крови.

Сбор мочи. Обычно используют четыре способа сбора мочи:

- в середине мочеиспускания (MSU);

12

-при помощи катетера (CSU);

-сбор утренней порции (EMU);

-сбор суточной мочи, объединение всех порций мочи за 24 часа.

Характер анализа определяет способ сбора мочи. Для большинства неколичественных методов (определение плотности мочи или микробиологический анализ) применяется MSU. Это небольшая порция мочи (10-15 мл), собранная во время мочеиспускания в любое время суток. CSU — это проба мочи, собранная у больного с помощью мочевого катетера.

Взятие на анализ образцов ткани (биопсия). Методика выполнения биопсии выбирается в зависимости от интересующего органа или ткани. При заболеваниях органов пищеварительной системы, биопсия сопровождает эндоскопические исследования. Фиброгастроскопия – при патологиях пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки. При наличии полипов осуществляют одновременное их удаление. Фиброколоноскопия. Ректороманоскопия – при патологиях толстого отдела кишечника.

При исследовании участков тканей или органов, расположенных у поверхности кожи, используют пункционную биопсию с использованием специфических тонких игл, введение которых осуществляется непосредственно в исследуемый участок.

Требования к условиям хранения и транспортирования образцов

биоматериалов в клиническую лабораторию

Условия хранения образцов биоматериалов, взятых у пациентов,

определяются стабильностью в этих условиях искомых аналитов. Максимально допускаемая нестабильность, выраженная в процентном отклонении результата после хранения от исходного уровня, не должна превышать половины размера общей ошибки определения, рассчитываемой из суммы биологической и аналитической вариации данного аналита.

Максимально допускаемое время хранения измеряется периодом времени, в

течение которого в 95 % образцов содержание аналита сохраняется на исходном уровне.

13

Стабильность аналитов в различных видах образцов (крови, мочи,

спинномозговой жидкости) и проб (сыворотке, плазме, осадке, мазке крови)

неодинакова Данные о стабильности проб следует учитывать и при их хранении после поступления в лабораторию. В отношении аналитов, нестабильных на свету, должны быть соблюдены соответствующие предосторожности (сбор материала в темную посуду, защита образца от прямого света) [2,3].

Контрольные вопросы:

1.На какие фазы подразделяется лабораторное исследование?

2.Какие критерии лежат в основе выбора метода исследования?

3.Что представляет собой унификация лабораторных методов исследования?

4.Перечислите техники взятия проб?

14

2 Лабораторная работа №2 Водно-электролитный обмен.

Кислотно-щелочной баланс организма

Цель занятия: Ознакомиться с основными методами определения содержания мочевины, креатинина и мочевой кислоты. Изучить методики определения клиренса креатинина, а также содержания белка в моче сульфосалициловым и пирогалоловым методами.

2.1 Фильтрационная, реабсорбционная функция почек

Функции почек разнообразны, часть из них связана с процессами выделения, в

которых почки выполняют ведущую роль, другая же часть подразумевает не выделительные функции почек. Почки принимают участие в регуляции:

-водного баланса организма;

-ионного баланса и состава жидкостей внутренней среды;

-постоянства осмотического давления жидкостей внутренней среды;

-кислотно-основного баланса, путем изменения экскреции водородных ионов,

нелетучих кислот и оснований;

-метаболизма белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и других органических соединений;

-эритропоэза, за счет внутренней секреции эритропоэтина;

-гемостаза, путем образования гуморальных регуляторов свертывания крови и фибринолиза.

Таким образом, почки отвечают за следующие функции: экскреторную,

гомеостатическую, метаболическую, инкреторную и защитную.

Но основной функцией почек, обеспечивающей ведущую роль в выделительной системе организма – это образование и выделение мочи.

Механизм мочеобразования состоит из трех основных процессов:

15

-клубочковой ультрафильтрации из плазмы крови воды и низкомолекулярных компонентов с формированием первичной мочи;

-канальцевой реабсорбции (т.е. обратного всасывания в кровь воды и необходимых для организма веществ из первичной мочи);

-канальцевой секреции ионов, органических веществ эндогенной и экзогенной природы.

2.2 Определение содержания мочевины

Синтез мочeвины происходит в пeчeни в основном из аммиака, который образуeтся при дезаминировании аминокислот, разложении пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Методы обнaружeния мочeвины:

-ксантгидроловые;

-гипохлоритные;

-диацетилмонооксимные;

-полуколичественные с использованием индикаторной бумаги;

-с использованием ионселлективных электродов;

-газометрические, гипобромитные;

-прямыe фотометрические;

-ферментативные.

Унифицированные методы определения мочевины: фенолгипохлоритный,

диацетилмонооксимный, уреазный и экспресс-методы с использованием индикаторной бумаги «Уреатест».

2.2.1 Определение сoдержания мочевины по цветной реакции с

диацетилмoнooксимoм в сыворотке крови и в моче

Принцип

16

Образование окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом при наличии тиосемикарбазида и солей жeлeза в кислой среде.

Реактивы

Раствор трихлоруксусной кислоты 10 %. Водный раствор диацетилмонооксима, 2,5 %. Водный раствор тиосемикарбазида, 0,25 %. Сернaя

кислотa, концентрированная. Ортофосфорная кислота 85 %. Хлорное железо, (основной раствор: 5 г хлорного железа растворяют в 100 мл воды и приливают 1 мл концентрированной серной кислоты; рабочий раствор: 1 мл основного раствора хлорного железа растворяют в 100 мл воды, приливают 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85 % ортофосфорной кислоты, хранят в темной посуде).

Стандартный раствор мочевины (1,0 г мочевины растворяют в 100 мл дистиллированной воды, из этого основного раствора готовят рабочий разведением основного в 10 раз). Цветной реактив (к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л

раствора тиосемикарбазида).

Материал для исследования

Моча, сыворотка крови. Профильтрованную мочу разводят изотоническим раствором натрия хлорида. Профильтрованную мочу разводят в соотношении 1:25

или 1:50, непосредственно перед анализом.

Ход работы

Смешивают в центрифужной пробирке 0,2 мл сыворотки, 0,8 мл дистиллированной воды, и 1,0 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Спустя 20 мин производят центрифугирование смеси.

Отбирают в чистую пробирку 0,5 мл надосадочной жидкости, затем приливают

5 мл цветного реактива. В последующем пробирку помещают на кипящую водяную баню 20 мин, после этого подвергают охлаждению 2-3 мин под проточной водой.

Определение экстинкции пробы проводят против контрольной пробы в кювете с толщиной слоя 10 мм на фотоэлектроколориметре при длине волны от 500 до 560 нм

(зеленый светофильтр).

17

Контрольную пробу подобна опытной, но вместо надосадочной жидкости 0,5

мл дистиллированной воды. Стандартную пробу ставят аналогично опытной, но разница в том, что сыворотку в ней заменяют 0,2 мл стандартным раствором мочевины.

Расчет выполняют по формуле:

Х ЕстЕоп.. 16,65 ,

где Х - концентрация мочевины (ммоль/л);

Еоп. - экстинкция опытной пробы;

Ест.- экстинкция стандартной пробы;

16,65-концентрация мочевины (ммоль/л) в стандартном растворе.

Определение мочевины в моче осуществляют так же, как и определение мочевины в сыворотке крови, но сыворотку заменяют 0,2 мл разведенной мочи.

Вместе с этим обрабатывают стандартную пробу, как описано ранее.

Расчет мочевины на суточное количество мочи проводят по следующей формуле:

Хсут = 16,65Е∙ Еоп∙ б∙ а ∙ К,

ст

где Х сут - концентрация мочевины (ммоль/л);

Е оп. - экстинкция опытной пробы;

Ест.- экстинкция стандартной пробы;

16,65-концентрация мочевины (ммоль/л) в стандартном растворе;

а – суточное количество мочи, мл;

б – количество мочи, взятое на анализ, мл;

К – коэффициент разведения мочи.

18

2.2.2 Уреазный метод выявления в сыворотки крови мочевины

Принцип

Уреаза разлагает мочевину на аммиак и углекислый газ. Образовавшийся аммиак в щелочной среде с фенолом и гипохлоритом натрия формирует индофенол синего цвета. Катализатор реакции - нитропруссид натрия. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины в анализируемом образце. Стадии реакции:

32NH2Cl + 2C6H5OH + 2NaOH 2п-аминофенол + 2NaCl + 2H2O

42п-аминофенол + 2C6H5OH + O2 индофенол + 2H2O

Реактивы

Уреаза (активность не менее 5 МЕ/мг). Трилон Б. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА - буфер, (0,0269 моль/л, рН 6,5: 0,50 г трилона Б растворяют в 30—40

мл воды, доводят рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и доливают водой в колбе до 50 мл)). Основной раствор уреазы в буфере, (10 МЕ/мл: 20 мг уреазы растворяют в 10 мл буфера). Рабочий раствор уреазы (основной раствор уреазы растворяют в бидистиллированной воде в отношении 1:4). Фенол. Натрия нитропруссид 2-водный.

Гидроксид натрия (1 моль/л; 0,26 моль/л). Цветной реактив (фенол — 0,11 моль/л,

нитропруссид натрия — 0,18 моль/л (0,0263 г нитропруссида натрия помещают в колбу (500 мл), добавляют 300 мл воды, перемешивают, затем добавляют 5,18 г

фенола и приливают воду до метки)). Гипохлорит натрия (основной раствор: 100 г

хлорной извести разводят в течение 15 мин с 170 мл воды, после этого приливают,

помешивая, раствор, из 170 мл воды и 70 г карбоната натрия; масса густеет, после разжижается; использовать на следующей день; надосадочную жидкость (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют через промытый водой фильтр). Рабочий раствор гипохлорита натрия (основной раствор гипохлорита натрия развести водой, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л). Мочевина. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании). Стандартный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л (15 мг

19

мочевины растворяют в колбе (500 мл) в 2 г/л бензойной кислоты). Натрия хлорид, 0,154 моль/л.

Оборудование

Спектрофотометр. Полуавтоматические микропипетки.

Материал для исследования

Сыворотка крови или плазма.

Ход работы

Перед анализом в сыворотку вносят 0,154 моль/л раствора хлорида натрия в отношении 1:9. Опытная проба: в пробирку вливают 100 мкл рабочего раствора уреазы, после добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Плотно закрывают пробкой,

тщательно перемешивают и инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 15 мин. По истечение инкубации вносят 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия и 300 мкл цветного реактива. Перемешивают и вновь инкубируют в течение от 20 до 30 мин при температуре 37 °С. Экстинкцию определяют в кювете с толщиной слоя в 10 мм при длине волны от 500 до 560 нм

(зеленый светофильтр) против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Контрольную пробу обрабатывают подобно опытной, но сыворотку меняют на

0,154 моль/л раствор NaCl.

Стандартную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки используют стандартный раствор мочевины. Измерение проводят против холостой пробы. Условия те же.

Расчет ведут по формуле:

Х= Еоп ∙ 0,5 ∙ 10,

Ест

где Х - количество мочевины в опытной пробе, ммоль/л;

Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ест – экстинкция стандартной пробы;

20