Биохимические основы неинфекционных патологических процессов. Лабораторный практикум

3.4 Определение содержания общего белка сыворотке крови биуретовым

методом

Принцип. В щелочной среде ионы меди с белками образовывают соединения фиолетового цвета (биуретовая реакция). Реакция обусловлена наличием пептидных связей.

Интенсивность окрашивания в установленном диапазоне пропорциональна концентрации белка. Содержание белка устанавливается по интенсивности светопоглощения от 540 до 560 нм фотометрически. Для расчета количества белка в исследуемом растворе используют калибровочный график, построенным по

перемешивая, внести 30 мл 10% раствора NaOH и 0,1 г KI и объем раствора довести до 100 мл). Стандарт белка (раствор или лиофилизат).

Ход работы

В пробирку 0, 5 мл сыворотки крови и 2,5 мл биуретового реактива, перемешивают, не допуская пенообразования. Через 30 мин определяют оптическую плотность на КФК в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны от 540 до 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки вносят 0,05 мл физиологического раствора. Расчет по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят ряд разведений стандартного раствора белка (таблица 4).

Таблица 4 – Разведение стандартного раствора белка

*Сст- концентрация стандартного раствора белка, указанного на флаконе.

Из каждого разведения взять по 0,05 мл, обработать, как пробу. Через 30-60 мин измеряют оптическую плотность против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Вычисляют факторы пересчета делением концентраций стандартных растворов на экстинкцию Аоп (оптическую плотность).

Выводят следующий фактор (F).

Расчет ведут по формуле:

42

Cоп = Аоп·F,

где Cоп – концентрация белкав пробе.

Если содержание белка в сыворотке более 100 г/л, ее разводят физиологическим раствором, а при расчетах степень разведения учитывается. Этот метод не используют для определения количества белка в моче или спинномозговой жидкости.

Клиническое значение

Содержание общего белка в сыворотке крове наблюдается при снижении синтеза белка, нарушении водного баланса, усиленном распаде и потере белка.

Гипопротеинемия выявляется при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции (энтерит, хронический панкреатит), экссудативной энтеропатии,

заболеваниях кожи (ожоги, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (хронические почечные заболевания), агаммаглобулинемии,

гипогаммаглобулинемии, неправильном питании, голодании. Снижение уровня белка в плазме крови может наступить из-за задержки воды при сердечной декомпенсации,

заболеваниях, сопровождающихся отеками или большими потерями белка с мочой,

например, при нефритах. Нарушением синтеза белка и уменьшением его вследствие этого в сыворотке крови сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.

Гиперпротеинемия наблюдается при плазмоцитоме, макроглобулинемии Вальденстрема, хронических воспалительных заболеваниях (ревматоидный артрит,

диффузные болезни соединительной ткани — коллагенозы, бронхоэктазы, цирроз печени), состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией (понос, рвота,

сахарный диабет).

При тяжелых травмах увеличение уровня общего белка в плазме крови может произойти за счет потери части внутрисосудистой жидкости. При острых инфекционных заболеваниях гиперпротеинемия возникает из-за усиленного синтеза белков острой фазы, при хронических инфекционных заболеваниях — увеличение синтеза иммуноглобулинов.

43

3.5 Определение содержания альбумина в сыворотке крови

Принцип.

Альбумин с бромкрезоловым зеленым (БКЗ) в слабокислой среде в присутствии детергента формирует окрашенный комплекс синего цвета.

Реактивы.

1 СН3СООН, 1 моль/л (в колбу (500 мл) вносят 10 мл ледяной СН3СООН и доводят объем водой до метки). NaOH 1 моль/л. Полиоксиэтиленлауриловый эфир

(бридж 35). Ацетатный буфер, 0,05 моль/л, рН 4,2 с добавлением детергента (0,85 г

бриджа 35 растврояют в 200 мл воды, приливают 50 мл I моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2-мл I моль/л раствора едкого натра и доводят объем водой до 1 л,

перемешивают). Бромкрезоловый зеленый (БКЗ) 1,2 ммоль/л (0,4292 г БКЗ растворяют в 200—-300 мл воды в колбе (500 мл) и доводят объем до метки). Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере (в колбу (1 л) вносят 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ,

доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом). Основной калибровочный раствор альбумина, 10 г/100 мл либо ампулированный 10 % раствор альбумина плацентарного.

Материал для исследования

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Ход определения

Опытная проба: 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, разведенной в

10 раз 154 ммоль/л раствора NaCl) перемешивают, не допуская пенообразования, с 4

мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере.

Через 5—10 мин определяют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны от 630 до 690 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Окраска стабильна в течение 8 ч. Холостую пробу ставят так же, как опытную,

но вместо сыворотки приливают 0,1 мл воды. Расчет по калибровочной кривой.

44

Построение калибровочной кривой: готовят ряд разведений основного

калибровочного раствора (таблица 5).

Калибровочные растворы обрабатывают, как опытные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл калибровочного раствора. Калибровочная кривая линейна до

концентрации альбумина 60 г/л.

Таблица 5 – Построение калибровочной кривой

Нормальные величины: 35—50 г/л (3.5-5,0 г/100 мл).

Клиническое значение

Гиперальбуминемия наблюдается при тех же состояниях, что и гиперпротеинемия. Гипоальбуминемия возникает при больших потерях белка, связанных с кровотечением при нарушении синтеза альбумина и увеличении процессов распада.

Оформить результаты. Вывод.

Контрольные вопросы:

1.В каких формах находится кальций в крови?

2.На чем основан метод определения общего кальция в сыворотке или плазме крови по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном?

45

3.Методы определения фосфора в крови?

4.Каков принцип определения содержания меди в сыворотке крови методом Шмидта?

5.В чем заключается биуретовая реакция?

6.Клиническое значение определение альбумина?

7.Перечислить функции кальция в организме человека?

46

4 Лабораторная работа № 4 Пигментный обмен. Ферменты крови

Цель занятия: Освоить методы определения ферментов и билирубина в

сыворотке крови.

4.1 Определение концентрации общего и связанного билирубина в

сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику,

Клеггорну, Грофу)

Эритроциты живут в среднем 110-130 дней. После этого они распадаются в клетках ретикулоэндотелиальной системы костного мозга, печени, селезенки и некоторых других органов. Гемоглобин, находящийся в эритроцитах, также подвергается разрушению.

Распад начинается с разрыва метинового мостика между I и II пиррольными ядрами порфиринового кольца с одновременным окислением двухвалентного железа в трехвалентное. В итоге образуется пигмент зеленого цвета - вердоглобин

(вердогемоглобин, холеглобин, псевдогемоглобин). Дальнейшая трансформация способствует потере вердоглобином железа и глобина, в следствие этого порфириновое кольцо преобразуется в цепь и образуется желчный пигмент зеленого цвета - биливердин. Практически весь биливердин с помощью ферментов восстанавливается в красно-желтый пигмент желчи - билирубин, который является нормальной составной частью сыворотки крови. Этот свободный (несвязанный)

билирубин (линейный тетрапиррол) нерастворим в воде, и не переходит в мочу давая непрямую реакцию ванден Берга. Таким образом, непрямой билирубин - это свободный билирубин. В клетках печени под действием фермента трансферазы свободный билирубин связывается с глюкуроновой кислотой, что сообщает ему хорошую растворимость в воде. Благодаря чему связанный билирубин легко выводится с мочой и реагирует с диазореактивом сразу же после прибавления его к сыворотке желтушных больных. Связанный билирубин (прямой) представлен двумя

47

пигментами: моно- и диглюкуронидом; последний составляет 75-80 % выделяемого желчью пигмента. Таким образом, билирубинглюкурониды - это прямой билирубин.

Принцип

Сульфаниловая кислота, в реакции с азотистокислым натрием образует диазофенилсульфоновую кислоту, та, реагирует со связанным билирубином сыворотки, изменяя окраску в розово-фиолетовый цвет. По интенсивности окраски,

судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный билирубин трансформируется в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности последнего фотоколориметрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между общим и связанным билирубином находят содержание несвязанного билирубина, дающего непрямую реакцию.

Реактивы

Кофеиновый реактив (5 г чистого кофеина, 7,5 г бензойнокислого натрия

(С6Н5COONa), 12,5 г кристаллического уксуснокислого натрия (CH3COONa)

растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают содержимое колбы до + 50-

60° С и перемешивают; после охлаждения доводят дистиллированной водой до 100

мл;). Физиологический раствор. Диазосмесь (а) диазореактив I (5 г сульфаниловой кислоты растворяют при подогревании в 300-400 мл дистиллированной воды,

приливают 15 мл концентрированной НСl (плотность 1,19 кг/л), если часть сульфаниловой кислоты в осадке, колбу необходимо нагреть в теплой воде; только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствора объем колбы доводят дистиллированной водой до 1 л; б) диазореактив II. (раствор азотистокислого натрия (NaNO2, 0,5 г/100 мл)). Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива II.

Ход работы

Втри пробирки (для определения общего билирубина, связанного билирубина

ипостановки контрольной реакции на цвет сыворотки) вносят реактивы по схеме

(таблица 6).

48

Таблица 6 - Данные для определения билирубина в сыворотке крови

Пробу для появления окраски оставляют в покое на 20 минут при определение общего билирубина. После 20 мин окраска пробы не изменяется.

Для определения связанного билирубина колориметрирование осуществляют через 10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин.

Для каждой опытной пробы ставят контрольную пробу на мутность сыворотки Колориметрируют растворы на КФК при зеленом светофильтре (длина волны от 500

до 560 нм) в кювете с шириной слоя 5 мм.

Расчет по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня несвязанного (свободного)

билирубина из общего его содержания вычитают показатель связанного билирубина

(прямого).

Клиническое значение

Существуют различные причины гипербилирубинемии. Если уровень билирубина в крови более 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл) появляется желтуха.

Патологические желтухи классифицируются различным образом.

Наблюдается прямая зависимость между механизмом их возникновения и различными фракциями билирубина.

49

Такие заболевания как, вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печении,

метастазы, жировая дистрофия, синдром Дубина—Джонсона вызывают повышение связанного прямореагирующего билирубина.

Повышение несвязанного непрямореагирующего билирубина вызывают:

гемолитическая анемия, пернициозная анемия, болезни Жильбера, синдроме Криглера—Найяра, синдроме Ротора.

4.2 Определение активности γ- глутамилтранспептидазы (ГГТП)

γ - Глутамилтрансфераза (γ-ГТФ) [(5-глутамил) - пептид: аминокислота 5-

глутамилтрансфераза, γ-глутамилтранспептидаза; К.Ф. 2.3.2.2] открыта в 1950 г;

выделена и очищена в 1963 г.

Фермент – катализатор реакции переноса γ-глутамилового остатка глутамиловой кислоты на акцепторный пептид или на L-аминокислоту.

Практически во всех системах органов человека содержится γ-ГТФ, при этом максимальная удельная активность наблюдается в тканях почек.

В зависимости от вида патологии количество фракций фермента может меняться.

Принцип

γ-ГТФ является катализатором переноса L-γ-глутамилового остатка с L-γ-

глутамил-n-нитроанилида на глицилглицин.

В ходе реакции освобождается n-нитроанилин, он определяется и служит мерой активности γ-глутамилтрансферазы.

γ-глутамил-n-нитроанилид + глицилглицин ГТФ γ-глутамил-глицилглицид + n-нитроанилин

Реактивы

50