Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факульте

3

„

FISH

В клинической цитогенетике метод FISH используют для уточнения характера перестроек, выявленных при кариотипировании и/или уточнениикариотипавслучаенедостаточногоразрешениядифференциального бэндинга. Следует помнить о вариабельности интенсивностифлуоресцентногосигнала,каквпределаходногопрепарата,так и между разными, а также неспецифического связывания зонда, что характерно для зондов к повторяющимся последовательностям ДНК. Для адекватной трактовки числа сигналов желательно в одной гибридизационной смеси иметь не только зонд к исследуемой последовательности ДНК, но и к другой — контрольной, заведомо известной по ее присутствию (и числе хромосом) в кариотипе. Эти нюансы следует учитывать при интерпретации результатов исследования. В этой главе будут описаны основные правила записи результатов гибридизации in situ конститутивного кариотипа согласно международной цитогеномной номенклатуре хромосом человека (ISCN, 2016).

ЕслиFISHпроводитсянапрепаратахметафазных(илипрофазных) хромосом после кариотипирования, то в формуле кариотипа, ставится символ точка (.) и символ ish (in situ hybridization), после пробела описывается результат гибридизации. В случае если FISH проводится изначальнобезрезультатовкариотипирования,пишетсятолькосимвол ish и после пробела описывается результат исследования. Название проанализированных локусов (зондов к ним) перечисляется через запятуюзаглавнымибуквами,суказаниемихналичия(+)илиотсутствия

(–).Возможнонаписаниеназваниягена,анезонда(вслучаеотсутствия его названия), согласно номенклатуре, предложенной Human Genome Organisation (HUGO). Число исследованного локуса записывается

сиспользованиемсимволаЧ(умножение).Дляописаниядериватных(ой) хромосом(ы)послесимволаish,ставитсяпробел,символ,описывающий структурную перестройку, в первых скобках ставится номер хромосомыилихромосом,вовлеченныхвобразованиеперестройки,вовторых скобках — точки разрыва, в третьих скобках — исследованный локус

суказанием его наличия (+) или отсутствия (–).

51

Например, 46,XX.ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75–). Данная запись означает, что по результатам кариотипирования был обнаружен нормальный женский кариотип, однако по результатам FISH показано, что на хромосоме 22 есть делеция в критическом регионе, ответственном за развитие синдрома Ди Джорджи (локус q11.2), что былоподтвержденоиспользованиемсоответствующегозондаD22S75. Данная ситуация возможна в связи с ограничением разрешающей способностикариотипирования,поскольку микроделециимогутбыть нераспознаныприанализедифференциальноокрашенныххромосом. Однако, поскольку синдром имеет клинические характеристики, то его наличие/ отсутствие можно доказать с помощью in situ гибридизации с использованием зондов, специфичных к локусу на хромосоме, в котором происходит делеция.

Запись ish del(4)(p16.3)(WHS–) означает, что кариотипирование не было проведено, делеция на хромосоме 4 была обнаружена с помощью in situ гибридизации с использованием соответствующего зонда.

Запись ish del(22)(q11.2q11.2)(D22S75–),del(22)(q11.2q11.2) (D22S75–) означает, что кариотипирование не было проведено, делециявкритическомрегионебылаобнаруженаспомощьюin situ гибридизации на обоих гомологах хромосомы 22.

Запись ish del(2)(р23р23)(ALK–) означает, что кариотипирование не было проведено, интерстициальная делеция на коротком плече хромосомы 2 была показана с помощью in situ гибридизации с использованием зонда к локусу 2p23, где локализуется ген

ALK.

Примеры написания результатов гибридизации для структурновидоизменённых хромосом представлены в таблице 5. Необходимо исследовать как минимум от трех до пяти метафазных пластинок без наложения хроматид/хромосом с гибридизацией к каждому использованному зонду, для исключения или подтверждения хромосомной перестройки.

Исследование нормальных (не перестроенных) по строению хромосом также описывается после символа ish и пробела, номера хромосомы с указанием бэнда и, в случае необходимости суббэнда (записывают без скобок), далее в круглых скобках описывается исследованный локус и его представленность с использованием символа ×. Например, запись 46,XY.ish 1q23.1(NTRK1×2) означает, что после кариотипирования был обнаружен нормальный мужской

52

кариотип. FISH с использованием зонда на локус, содержащий ген NTRK1 (сегмент 1q23.1) показал нормальный паттерн гибридизации на препаратах метафазных хромосом.

Запись 46,XX.ish 11q22.3(ATM×2) означает, что после кариотипирования был обнаружен нормальный женский кариотип, FISH с использованием зонда к генуATM, локализованном в сегменте 11q22.3, показалнормальныйпаттернгибридизациинапрепаратахметафазных хромосом.

Запись 46,XX.ish X(DXZ1×2,DYZ3×0,SRY×0) означает, что FISH,

проведенный на препаратах метафазных хромосом после кариотипирования,показалотсутствиегибридизационныхсигналовцентромерного района Y-хромосомы (альфа сателлитная ДНК, зонд DYZ3)

игена SRY, и показал присутствие центромерного района обеих Х-хромосом (зонд DXZ1).

Вслучае интерфазной in situ гибридизации используют символы nucish.Например,записьnucish(D21S65×2)илиnucish21q22(D21S65×2)

означает, что в ядре присутствует две копии локуса D21S65 (сегмент

21q22) хромосомы 21.

Зонды на разные локусы одной и той же хромосомы перечисляют понаправлениюотpterкqter.Например,nucish(KAL1,DXZ1,XIST)×2

означает,чтовядреприсутствуютподвекопиилокусовKAL1(Xp22.3), XIST (Xq13.2) и центромерного района (зонд DXZ1, локус Xp11.1- q11.1) Х-хромосомы.

Вслучае если используются несколько зондов на одну и ту же или на разные хромосомы, их перечисляют через запятую без пробела, одинаковое присутствие таких локусов в ядре указывают символом умножения,вынесеннымзаскобку.Записьnucish(D21S65,D21S64)×3 означает, что в ядре присутствуют по три копии локуса D21S65

иD21S64 хромосомы 21.

Вслучае если число локусов разное, то их перечисляют через запятую, а число сигналов указывают сразу же, не вынося их за скобки. Локусы перечисляются по следующему порядку: сначала к X и Y-хромосомам, затем к аутосомам в порядке увеличения порядкового номера аутосомы. Например, запись nuc ish (DXZ1×3, DYZ3×1,D13S319×1,D18Z1×2) означает, что в ядре присутствует три копии хромосомы Х, одна копия хромосом Y и 13, две копии хромосомы 18.

При интерфазной FISH подсчитывают число сигналов от каждого анализируемогозондакакминимумв50интерфазныхядрах.Вслучае

53

подозрения на мозаицизм не менее 100 интерфазных ядер для каждого анализируемого зонда.

•-…•

1.Напишите формулу кариотипа после проведения кариотипирования с женским набором гоносом с делецией дистального отдела q-плеча хромосомы 22 (локус 22q13.3), подтвержденного с использованием локус-специфического зондаARSA.

2.Напишите формулу кариотипа после проведения кариотипированиясмужскимнаборомгоносомснеподтвержденнойметодомFISH микроделецией в критическом регионе хромосомы 7, ответственном за развитие синдрома Вильямса, идентифицированной с помощью зонда на ген эластина (ELN).

3.Напишите формулу женского сбалансированного кариотипа

сдицентрической Робертсоновской транслокацией хромосом 14 и 21, точки разрыва которой были уточнены с помощью метода FISH,

сиспользованиемцентромерныхзондовD14Z1/D22Z1иD13Z1/D21Z1, сегменты 14p11.2 и 21p11.2 соответственно.

4.Напишитеформулумужскогокариотипасобнаруженнойдобавочноймаркернойхромосомойпослепроведениякариотипирования,идентифицированнойспомощьюFISH,какдериватхромосомы8сположительной гибридизацией с центромерным зондом хромосомы 8 (D8Z1).

Таблица 5

54

55

„ ƒ

Анеуплоидия — геномные мутации, связанные с изменением числа отдельных хромосом, некратные гаплоидному.

Дериватнаяхромосома—видоизмененнаяхромосомавследствие структурной перестройки между двумя и более хромосомами, с сохраненной центромерой.

Зонд— последовательность молекулы нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), комплементарная последовательности искомой ДНК /РНК на анализируемом препарате.

Инверсия — внутрихромосомная перестройка, переворот фрагмента хромосомы на 180 градусов.

Инсерция — межхромосомная перестройка, связанная с перемещением фрагмента одной хромосомы внутрь другой.

Кариотипирование — определение числа и анализ структуры митотическиххромосомсиспользованиемдифференциальнойокраски, позволяющей идентифицировать все хромосомы набора.

Кольцеваяхромосома—внутрихромосомнаяперестройка,пред- ставляющая собой одиночные (реже двойные) замкнутые кольца с одной или двумя центромерами (моноили дицентрические, соответственно).

Криптическая, или скрытая, перестройка — небольшая по размерам структурная перестройка, которую невозможно детектировать с помощью кариотипирования.

Маркерная хромосома — результат как меж- и так и внутрихромосомныхперестроек,представляютсобойаномальные,неидентифицируемые с помощью методов дифференциального окрашивания хромосомы,которые(вобщем)поразмерамравныилинепревышают размеры хромосомы 20 на одной и той же метафазной пластинке.

Моносомия—анеуплоидия,связаннаясотсутствиемоднойиз гомологичных хромосом.

Нуллисомия — анеуплоидия, связанная с отсутствием обеих гомологичных хромосом.

57

1.Баранов В. С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. СПб.: Изд-во «Н–Л», 2007. 439 с.

2.Кузнецова Т. В., Шилова Н. В., Творогова М. Г., Харченко Т. В., ЛебедевИ.Н.,АнтоненкоВ. Г.Практическиерекомендациипообеспечению качестваинадежностицитогенетическихисследований//Медицинская генетика 2019; 18(5): 3–27. DOI: 10.25557/2073-7998.2019.05.3-27

3.Рубцов Н. Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: учеб. пособие. Новосибирск: Новосиб. гос. ун-т., 2006. 152 с.

4.Руководство по клинической эмбриологии / В. С. Корсак, А. В. Балахонов, Н. К. Бичевая, Р. А. Кузнецова, О. А. Леонтьева, Ю. А. Логинова, И. В. Решетников, А. Ф. Сайфитдинова, И. Л. Трофимова. 2-е изд. М.: СИМК, 2019. 224 с.

5.Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Учебно-методическое пособие. 2-е изд. испр. и доп. СПб: Свое издательство, 2011. 108 с.

6.Смолянинов А. Б., Хрупина А. С., Юркевич Ю. В., Пирожков И. А., Супильникова О. В., Крылов К. М., Крылов П. К., Козулин И. Д. Использование полимера гидроксиэтилцеллюлозы в качестве носителя для аллогенных фибробластов при лечении последствий термических ожогов // Вестник МАПО. 2013. Т. 5. № 4. С. 7–12.

7.Цитогенетические методы. Медицинские лабораторные технологии / Т.В.Кузнецова,Ю.А.Логинова,О.Г.Чиряеваидр.;подред.А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 1999. 656 с.

8FISH: A practical Approach (ed. by B. Beatty, S. Mai, J. Squire). Oxford university press, 2002. 255 p.

9.Haugland R. P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. 6 ed. Molecular Probes, 1996. 679 p.

10.ISCN2016:AnInternationalSystemforHumanCytogenomicNomenclature. Reprint of: Cytogenetic and Genome Research. 2016. Vol. 149. № 1–2. 139 р.

11.Matthiesen S. H., Hansen C. M. Fast and non-toxic in situ hybridization withoutblockingofrepetitivesequences.2012.PlosOne.V. 7.Is. 7.e40675. Р. 1–8.

12.Murphy D. B. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Wiley-Liss, 2001. 325 p.

13.Stainingprocedures.4ed.(ed.byG. Clark).WilliamsandWilkins,Baltimore, 1981. 512 p.

59