Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факульте

Протокол

1.Довести объем реакционной смеси водой до 100 мкл.

2.Добавить равный объем (100 мкл) хлороформ–изоамилового спирта, встряхнуть и отцентрифугировать 2 мин при 3000g.

3.Аккуратно собрать водную (верхнюю) фазу в новую пробирку.

4.Добавить 1/4 объема (25 мкл) 10М ацетата аммония и переме-

шать.

5.Добавитьравныйобъемизопропанола(125мкл)иинкубировать 10 мин при комнатной температуре.

6.ОсадитьДНКцентрифугированиемпри12 000gвтечение15 мин

ипромыть осадок охлажденным 70% этанолом.

2.2.6. 6. •

Необходимые растворы

•РНК полимеразы: T3, T7 или SP6.

•10х Т3, Т7 буфер: 200мМ Tris-HCl (pH 8,0); 40мМ MgCl2, 10мМ спермидин; 250мМ NaCl.

•10хSP6буфер:200мМTris-HCl(pH7,5);30мМMgCl2;10мМспер-

мидин.

•Смесь нуклеотидов: 10мМ АТР; 10мМ СТР; 10мМ GTP; 7,5мМ ТТР.

•Меченый предшественник: 1мМ меченый UTP. Протокол

1.Собрать реакционную смесь: 2 мкл 10х буфера 1 мкл смеси нуклеотидов 1 мкл меченого UTP

1 единица РНКазина

1 мкг линейной ДНК матрицы

10 единиц РНК полимеразы H2O до 20 мкл

2.Быстро перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным центрифугированием.

3.Инкубировать при +37°С (Т3 и Т7) или +40°С (SP6) в течение 2 часов.

4.Добавить 10 единиц ДНКазы, свободной от РНКазы, и инкубировать при +37°С 15 мин.

5.Остановить реакцию добавлением 2 мкл 200мМ ЭДТА.

31

6.Добавить РНК носитель — 1 мкг дрожжевой тРНК и 5 мкл 5М ацетата аммония.

7.Осадить РНК добавлением 2,5 объемов охлажденного этанола. Инкубировать при –20°С в течение ночи.

8.Собрать осадок центрифугированием при 12 000g в течение 20 мин при +4°С и промыть осадок охлажденным 70% этанолом.

2.2.7. 7. • •

Необходимые растворы

•Инкубационный буфер: 0,1M Tris-HCl (pH 7,5); 0,1M NaCl; 2мМ MgCl2; 0,05% Triton X-100.

•Блокирующий реагент: 3% БСА на инкубационном буфере.

•Разведение антител: для биотинилированных зондов используют стрептавидин конъюгированный с щелочной фосфатазой, разведенный в инкубационном буфере 1:1000–1:5000; для зондов, меченных дигоксигенином, используют антитела против дигоксигенина, конъюгированные с щелочной фосфатазой, разведенные

винкубационном буфере 1:500–1:1000.

•Буфердлящелочнойфосфатазы:0,1MTris-HCl(pH9,5);0,1MNaCl; 50мМ MgCl2.

•КонцентрированныйрастворNBT(нитротетразолийсиний):75мг/мл

вдиметилформамиде.

•КонцентрированныйрастворBCIP(5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат): 50 мг/мл в 50% диметилформамиде (при использовании калиевой соли BCIP) или воде (при использовании натриевой соли BCIP).

•Раствор для детекции: непосредственно перед использованием к10млбуферадлящелочнойфосфатазыдобавить44мклконцентрированного раствора NBT и 33 мкл концентрированного раствора BCIP, беречь от света.

Протокол

1.Приготовитьвлункахиммунологическогопланшетасериюразведенийзондаот1нг/мклдо0,1пг/мкл.Дляэтогонанестивлункииммунологического планшета по 9 мкл дистиллированной воды, а для первого разведения 9,5 мкл. Добавить к первой капле 0,5 мкл раствора меченого зонда, аккуратно перемешать пипетированием; затем из первой капли перенести 1 мкл во вторую каплю и так допоследней лунки.

2. По 1 мкл из каждого разведения нанести на нейлоновую мембрану и высушить.

32

3.Облучить мембрану УФ в течение 2–3 мин.

4.Смочить мембрану в инкубационном буфере.

5.Перенести мембрану в емкость с блокирующим раствором

иинкубировать 15 мин при комнатной температуре.

6.Провестииммунохимическуюреакцию.Мембрануинкубируют в растворе антител в течение 30 мин при +37°С.

7.Отмыть мембрану в трех сменах инкубационного буфера по 5 мин при комнатной температуре и постоянном покачивании.

8.Перенести мембрану на 1 мин в буфер для щелочной фосфа-

тазы.

9.Инкубировать мембрану в растворе для детекции в течение 1–3 часов в темноте при комнатной температуре.

10.Хорошо промыть мембрану проточной водой и высушить.

Зонд можно использовать для гибридизации, если на мембране выявляется точка, содержащая 1 пг меченой ДНК, для высокоповторяющихся последовательностей ДНК выявление 5 пг зонда можно считать достаточным.

2.3. ƒ

IN SITU

Итак, любая гибридизация in situ состоит из следующих последовательных этапов: предгибридизационные обработки, денатурация и гибридизация, постгибридизационные отмывки и детекция связавшихся зондов.

Предгибридизационные обработки (вариант 1)

1.Поставить препараты инкубироваться на +60°С в течение 1 часа.

2.Препараты поместить в однократный цитратный буфер с детергентом (1×SSC + 0,02% Tween 20) от 30 с до 2 мин при температуре

+37°С.

3.Далее провести в двух сменах в 1×SSC, по 2–5 мин при температуре +37°С.

4.Поместить препараты в стакан с дистиллированной водой на 30 с для отмывки солей, далее дегидратировать в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин в каждом.

33

Предгибридизационные обработки (вариант 2)

1.Поставить препараты инкубироваться на +60°С в течение 1 часа.

2.Дегидратировать препараты в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин в каждом.

Примечание

Вслучае необходимости после выполнения дегидратации необходимо провести предобработки препаратов с помощью протеолитических ферментов, которые исключат некомплементарное связывание зонда или улучшат доступ зонда к ДНК на препарате. Так, например, для отсутствия некомплементарного связывания ДНК зонда с РНК, которая может сохраниться на препарате, рекомендуется использовать предобработку препаратов РНКазой А. В случае, если имеется экранирование молекулы ДНК белками, или наличия цитоплазмы на препарате, рекомендуется обработка препаратов протеазами. Если необходимы и предобработки с помощью РНКазы А и с помощью протеаз, то их проводят последовательно: сначала с помощью РНКазы, затем с помощью одной из протеаз. Протоколы таких предобработок и последующая постфиксация материала представлены ниже.

Протокол А. Предобработка препаратов РНКазой А

Свободная от ДНКазы РНКаза А: 20 мг/мл в 10мМ Tris-HCl (pH 7,5);15мМNaCl,инкубироватьпри90°Свтечение15мин,расфасовать и хранить при –20°С.

Рабочий раствор РНКазы: 100 мкг/мл в 2×SSC, готовить перед использованием.

1.Сухие препараты размочить в 2×SSC в течение 5–20 мин при комнатной температуре.

2.Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора РНКазы, закрыть кусочкомпарафильманеобходимогоразмераиинкубироватьвовлажной камере 1 час при +37°С.

3.Промыть в 3 сменах 2×SSC по 5 мин при комнатной температуре.

Протокол В. Предобработка препаратов пепсином

Концентрированный раствор пепсина: 10% в стерильной воде, прокипятить 15 мин, охладить до комнатной температуры и расфасовать, хранить при –20°С.

34

Рабочий раствор пепсина: 0,005% в 0,1М Hcl.

1.Сухие препараты размочить в 2×SSC в течение 5–20 мин при комнатной температуре.

2.Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора пепсина, закрыть кусочкомпарафильманеобходимогоразмераиинкубироватьвовлажной камере 10 мин при +37°С.

3.Промыть в 3 сменах по 5 мин 1×PBS с добавлением 50мМ

MgCl2

Протокол С. Предобработка препаратов протеиназой К

КонцентрированныйрастворпротеиназыК:20мг/млвстерильной воде, инкубировать 2 часа при 37°С, расфасовать и хранить при

–20°С.

Рабочий раствор протеиназы К: 2 мкг/мл протеиназы К в 2 мМ

CaCl2; 20мМ Tris-HCl (pH 7,5).

1. Сухие препараты размочить в 2×SSC в течение 5–20 мин при комнатной температуре.

2. Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора протеиназы К, закрыть кусочком парафильма необходимого размера и инкубировать во влажной камере 10 мин при +37°С.

3. Промыть в 3 сменах по 5 мин 1×PBS с добавлением 50мМ

MgCl2

Протокол D. Предобработка препаратов ДНКазой I

1.Раствор ДНКазы I развести в буфере, содержащем 400мМ трис-

HCl, рН 8,0; 100мМ MgSO4, 10мМ CaCl2 в концентрации, указанной фирмой-производителем.

2.Сухие препараты размочить в 2×SSC в течение 5–20 мин при комнатной температуре.

3.Нанестинастекло200мклрабочегораствораДНКазыI,закрыть кусочкомпарафильманеобходимогоразмераиинкубироватьвовлажной камере 1 час при +37°С.

4.Промыть в 3 сменах по 5 мин 1×PBS с добавлением 50мМ

MgCl2

Протокол Е. Постфиксация препаратов после предобработок

иперед денатурацией и гибридизацией

1.Инкубироватьпрепаратывфиксаторе(1%PFAна1×PBS)10 мин при комнатной температуре.

35

2.Отмыть в 2 сменах 1×PBS, 50мМ MgCl2 по 5 мин.

3.Дегидратировать препараты в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин в каждом.

Растворение зонда в гибридизационном буфере

Вслучаеиспользованиякоммерческихзондовигибридизационных смесей,смешатьихсогласноинструкциипроизводителя.Прииспользовании зондов, полученных самостоятельно (например, с помощью ПЦР), растворить их в следующем гибридизационном буфере:

Протокол I. Для олигонуклеотидных зондов

40% деионизированный формамид

10% декстран сульфат

2×SSC

зонд в концентрации 10 нг/мкл носитель(например,ДНКспермылососяилит-РНК)в50кратном

избытке по отношению к концентрации зонда вода автоклавированная

Протокол II. Для зондов длиной 200 н.п. и выше

50% деионизированный формамид

10% декстран сульфат

2×SSC

зонд в концентрации 50–100 нг/мкл носитель(например,ДНКспермылососяилит-РНК)в50кратном

избытке по отношению к концентрации зонда вода автоклавированная

Протокол III для зондов любой длины с замещением формамида (был разработан для парафиновых срезов тканей различных опухолей)

15% этиленкарбонат

20% декстран сульфат

600 мМ NaCl

10 мМ цитратный буфер; pH 6.2. зонд в концентрации 50–100 нг/мкл

ПротоколIVдлязондовлюбойдлинысзамещениемформамида(был разработан для парафиновых срезов тканей различных опухолей)

45% этиленкарбонат

36

10% декстран сульфат носитель Cot-1 ДНК 0,1 мг/мл

300 мМ NaCl

5 мМ фосфатный буфер; pH 7.5.

Денатурация и гибридизация

1.Нанести под покровное стекло необходимый объем гибридизационной смеси. Края покровных стекол заклеить резиновым клеем.

2.ПровестиодновременнуюденатурациюДНКнапрепаратеиДНК зонда при температуре +70–85°С в течение 2–8 мин, поместив стекла на нагревательную поверхность специализированного термоблока. При отсутствии прибора, препараты (без нанесения на них гибридизационной смеси!) поместить в стакан (кювету) с 2×SSC, pH 7.0

c 70-процентым формамидом при +70–80°С на 2–5 мин, после чего быстро перенести в охлажденный до –20°С 70% этанол на 2 мин (для предотвращения ренатурации цепей молекулы ДНК на препарате). Дегидратировать препараты в серии охлажденных до –20°С спиртов (70°, 80°, 96° этанол) по 5 мин в каждом. Высушить на воздухе

итолько после этого (!) перейти к пункту 1 этапа денатурации

игибридизации.Следуетотметить,чтоприиспользованиипротоколов III и IV при растворении зондов в гибридизационном буфере температура денатурации может быть снижена до +67°С.

3.Гибридизацию проводить во влажной камере при комнатной температуре или при +37°С от часа до ночи. Время гибридизации подбирать эмпирически. Для повторяющихся последовательностей ДНК, как правило, достаточно непродолжительной гибридизации в течение часаилинесколькихчасов,длялокус-специфичныхзондов,илизондов, специфичныхк(суб)теломернымучасткамхромосомнеобходимаболее длительная гибридизации, как минимум, в течение ночи.

Постгибридизационные отмывки (вариант1)

1.Осторожно удалить резиновый клей, отмыть препараты в трех сменах 2×SSC pH 7.0 по 5 мин в каждом при температуре 42°С.

2.Поместить препараты в стакан с дистиллированной водой на 30 с для удаления солей, далее дегидратировать в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин

вкаждом.

3.Нанести на препарат фотозащитный раствор с DAPI (1мг/мл) и заключить под покровное стекло.

37

Постгибридизационные отмывки (вариант 2)

1.Аккуратно снять пинцетом резиновый клей.

2.Поместитьстеклавстаканчикс50%формамидом,2×SSC,предварительно нагретым до +42°С и подождать, пока покровные стекла съедут с препаратов.

3.Дважды отмыть препараты в 50% формамиде, 2×SSC при +42°С по 5 мин, постоянно покачивая.

4.Дважды отмыть препараты в 1×SSC при +42°С по 5 мин, постоянно покачивая.

5.Поместить препараты в стакан с дистиллированной водой на 30 с для отмывки солей, далее дегидратировать в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин в каждом.

6.Нанести на препарат заключающий фотозащитный раствор

сDAPI (1мг/мл) и заключить под покровное стекло.

Примечание

КратностьраствораSCC,егоpH,температураипродолжительность отмывок могут варьировать. Условия жесткости отмывок описаны в главе 1.

Если в гибридизационной смеси имеется зонд с флуорохромом, спектр эмиссии которого перекрывается со спектром флуоресценции DAPI, то в заключающий раствор можно добавить другой краситель для ДНК (например, йодистый пропидий, Sytox Green или DRAQ5), либо совсем не добавлять красителя.

Воднойгибридизационнойсмесиможносмешатьсразунесколько зондов, специфичных к разным участкам одной и той же хромосомы илинегомологичныххромосом.Приэтомследуетпомнить,чтоспектр флуоресценции используемых зондов не должен перекрываться, чтобы была возможность определить принадлежность сигнала хромосоме. Например, смешать зонд, специфичный к центромерному району хромосомы 13, меченный Alexa 488 и зонд, специфичный к центромерномурайонухромосомы18,меченныйCy3.Принципкомбинации флуорохромов с неперекрывающимися спектрами излучения при составлении гибридизационной смеси описан в главе 1.

Иммунохимическая детекция гибридизовавшегося зонда

В случае если используются зонды, несущие в качестве репортерных молекул биотин или дигоксигенин, то в протоколе постгибридизационных отмывок пропускают этапы дегидратации и заключения препарата, стекла проводят по следующему протоколу.

38

1.На отмытые после гибридизации препараты нанести по 500 мкл блокирующего раствора (3% БСА в 4×SSC+0,1% Tween 20 или 1% БСА в 1×PBS +0,1% Tween 20), накрыть кусочками парафильма, поставить во влажную камеру и инкубировать 40 мин при +37°С.

2.Стряхнуть блокирующий раствор вместе с парафильмом.

3.Нанести200–500мклраствораантителкрепортерноймолекуле, конъюгированных с флуорохромом (в случае зондов, меченных биотиномвместоантител,можноиспользоватьавидинилистрептавидин, конъюгированный с флуорохромом). Накрыть новым кусочком парафильма, инкубировать во влажной камере 60 мин при +37°С. Антитела разводить в блокирующем растворе, в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

4.Отмывать в трех сменах 4×SSC с добавлением 0,1% Tween 20 по 5 мин при +37°С, при покачивании.

5.Поместить препараты в стакан с дистиллированной водой на 30 с для отмывки солей, далее дегидратировать в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 3–5 мин в каждом.

6.Нанести на препарат заключающий фотозащитный раствор

сDAPI (1мг/мл) или другим красителем и заключить под покровное стекло.

Примечание

Вслучаенеобходимостиможнопровестидополнительноеусиление сигналаметодоммногослойнойокраскиантителами.Дляэтогоповто- ряют2–4этапысиспользованиемразличныхантител,распознающих последовательно предыдущие (например, на первом этапе использовались антитела против дигоксигенина на основе иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с флуорохромом, на втором использует антитела против иммуноглобулинов мыши на основе иммуноглобулиновкозы,конъюгированныесфлуорохромом,далееможноиспользовать антитела против иммуноглобулинов козы). Усилить сигнал зонда с биотином можно за счет дополнительного шага детекции, используя инкубацию с антителами к авидину, конъюгированными с биотином, которые затем также детектировать с помощью меченного флуорохромом авидина. Для этого на препарат нужно нанести раствор антител в блокирующем буфере, инкубировать во влажной камере 60 мин при +37°С, выполнить пункты 4–6. При необходимости эту процедуру можно проводить многократно, однако больше пяти этапов окрашивания проводить не рекомендуется, поскольку из-за многократноувеличенногонеспецифическогосвязыванияполученные

39

результаты будет трудно интерпретировать. Все этапы по возможности проводить в темноте.

Если предполагается, что на препарате может быть эндогенный биотин (что приведет к неспецифическому связыванию авидина и, следовательно, к неспецифической флуоресценции на препарате), то необходимо параллельно проводить контрольный эксперимент. Для этого препарат провести по всем этапам, однако в гибридизационную смесь не добавлять зонд.

2.4. „ IN SITU

ƒ

Для детекции негомологичных хромосом зондами, меченными одинаковыми флуоресцентными метками или большего числа негомологичных, как интерфазных, так и метафазных хромосом, необходимо проведение нескольких последовательный туров гибридизации на одном и том же препарате. Для этого препараты проводят по всем этапам: предгибридизационных обработок, денатурации и гибридизации, отмывок, интерпретации полученных результатов, после чего осторожно удаляют покровное стекло, опускают препарат в стакан (кювету) с дистиллированной водой на 1 мин, дегидратируют в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 2– 3 мин в каждом. Наносят гибридизационную смесь под покровное стекло, края стекла заклеивают резиновым клеем и проводят вторую денатурацию и гибридизацию. Следует при этом помнить, что температураденатурациидолжнабытьсниженаскаждымгибридизационным туром примерно на 3–5 градусов, в связи с худшей сохранностью хроматина на стекле после первого тура. При этом, слишком низкая температура денатурации (например, +68°С и ниже) может привести к тому, что зонды с предыдущего тура останутся связанными на препарате и не отмоются, что будет затруднять анализ.

2.5. „

FISH

ВслучаеинтерпретациирезультатовметафазногоFISHпрепараты рекомендуетсязаключатьвсредусDAPI,которыйпозволяетполучить дифференциальное окрашивание (Q-подобный бэндинг), что помога-

40