Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факульте

ет идентификации хромосом. Зная, какие зонды были нанесены на препарат при гибридизации, и каким участкам хромосом они соответствуют,атакжеидентифицируяпобэндингухромосомы,можно уточнить или подтвердить характер перестройки или анеуплоидию,

атакже проверить хромосом-специфичность зонда.

Втаблице1приведеныобщиепринципы,лежащиевосновеинтерпретации результата ДНК гибридизации на интерфазных ядрах. В таблице дана оценка наиболее часто встречающихся сигналов, соответствующихнорме(дисомии),моносомии,трисомииинуллисомии. Однако предложенные принципы подходят и к интерпретации большего числа хромосом (четырех, пяти и т. д.).

Также следует отметить, что при оценке результатов FISH на интерфазных ядрах, считается, что если сигналы от одного зонда расположены друг от друга на расстоянии, равном диаметру этого сигнала и они сами между собой равны друг другу по размерам, то такие сигналы характерны для двух хроматид одной и той же хромосомы. Однако следует помнить, что из-за близкого расположения хроматид/ гомологичных хромосом или взаимного наложения хроматид/гомологичных и негомологичных хромосом однозначная интерпретация

41

результатов затруднена. Для более адекватного подсчета числа сигналов,всомнительныхслучаяхрекомендуетсяставитьдополнительныетурыгибридизациисзондами,специфичнымикдругимрайонамизучаемых хромосом, по протоколу, описанному в пункте 2.4. Например, первыйтургибридизацииставитсясцентромернымзондомкхромосоме,

авторой тур — с теломерным или локус-специфическим зондом.

Втаблице 2 приведены возможные неудачи при поведении FISH и пути их решения.

Таблица 2

• Œ• • …• •ˆŒ • • FISH, ˆ• Ž-•• …‘…-• … Œ•… •’•-…•

42

2.6.

ƒ “„” FISH

С помощью FISH можно не только детектировать ДНК на цитологических препаратах, но и РНК. Такую модификацию метода используют, как правило, в научных экспериментах, для цитологического подтверждения транскриптов, изучения расположения транскриптов (в ядре или цитоплазме), распределения транскриптов по клеточным слоям ткани и по клеточному циклу и т. д.

Также следует обратить внимание на то, что в связи с тем, что детектируются транскрипты, а не молекула ДНК на препаратах, для более адекватной интерпретации полученных после гибридизации результатов, необходима параллельная постановка контрольных экспериментов, как положительных, так и отрицательных, а также необходим отдельный контрольный эксперимент на автофлуоресценцию. Только при соблюдении всех контрольных экспериментов, можно с уверенностью описывать детекцию транскриптов.

Что касается зондов, которые используются в РНК FISH, то они подбираются комплементарными тем последовательностям ДНК, транскриптыкоторыхпланируетсяизучитьидолжнысоответствовать всем требованиям, описанным в главе 1. Следует еще раз отметить, что двуцепочечные зонды должны быть предварительно денатурированы перед нанесением их на препарат. Зонды, меченные авидином или дигоксигенином, нуждаются в имуноцитохимической детекции.

Также следует помнить, что при работе по протоколу РНК FISH необходимоиспользоватьисключительноавтоклавированныерасходныематериалы(носики,эппендорфыит. д.)иводу(илиспециальную готовую воду без РНКазной активности), чтобы избежать попадание РНКаз.

• (whole mount FISH)

Фиксация материала

1.Отобрать материал на льду в холодный 1×PBS.

2.Поместить образец в холодный 4% PFAна 1×PBS, фиксировать от 30 мин до 4 часов или ночь (в зависимости от объема ткани) при

+4°C.

3.Отмыть в двух сменах PBT (1×PBS + 0,1% Tween20) при +4°C.

43

Предгибридизационные обработки

4.Обработать 0,5% Тритоном Х-100 30 мин при комнатной температуре или ночь при +4°C (в зависимости от объема образца).

5.Отмыть в трех сменах 1×PBS по 5 мин при комнатной темпера-

туре.

6.Дегидратироватьвсерииэтанол(метанол)/PBTрастворов:25%, 50%, и 75% при комнатной температуре по 5 мин в каждом. В конце провести два раза в 100% этаноле. На этом этапе образцы могут хра- нитьсяв100%этаноле(втораяпорция)до6меспритемпературе–20°C. Альтернативно,повозможностиможнопровестипункты1–16изатем оставить образцы на хранение до 6 мес при температуре –20°C.

7.Регидратировать в обратном порядке в серии этанол (метанол)/ PBTрастворов:100%этанол(втораясменаспункта6),75%,50%,25% при комнатной температуре по 5 мин в каждом.

8.Отмыть дважды в PBT при комнатной температуре по 5 мин.

9.Провести осветление образцов от пигментов в 1–6% перекиси водорода на PBT в течение 1 часа при комнатной температуре. Этот этап можно пропускать и после пункта 8 сразу перейти к пункту 11. Помнить, что при связывании с каталазой, перекись водорода будет активно разлагаться на кислород и воду, и вызывать бурное вспенивание.

10.Отмыть три раза в PBT при комнатной температуре по 5 мин.

11.Обработать образец с помощью протеиназы К. Этот этап позволяет избавиться от белков, которые могут экранировать нуклеиновые кислоты, и помогает лучшей пермеабилизации тканей. Однако следует учесть, что после этой обработки образцы могут стать очень хрупкими. Существуют два основных момента, на которые следуют обратить внимание: это концентрация и время обработки ферментом. Ниже представлены таблицы 3 и 4, которые можно использовать для образцов эмбрионов курицы и мыши, находящиеся на разных стадиях развития, и подбирать оптимальные параметры для тканей и эмбрионов других видов.

12.Остановить протеиназу с помощью отмывки в свежеприготовленном 2 мг/мл глицине на PBT в течение 10 мин при комнатной температуре.

13.Отмыть от глицина дважды в PBT по 5 мин каждый.

14.Постфиксацияобразцавсвежеприготовленном4%PFAнаPBT

втечение 20 мин при комнатной температуре.

15.Отмыть трижды по 5 мин в PBT при комнатной температуре.

44

Таблица 3

•…• -•• Œ …• •• ‡ ‡ •‚… • • – ••…- ˆ•

• • —•‡ … - ‚Œ …†•

16.Поместить образец в смесь гибридизационного буфера (2×SSC

и40-проценный формамид) с PBT в соотношении 1:1 на 10 мин при комнатной температуре.

17.Удалить смесь, добавить такой же объем гибридизационного буфера (2×SSC и 40-проценный формамид) на 10 мин, оставить при комнатной температуре.

18.Заменитьгибридизационныйбуфернановуюпорциюиоставить образец инкубироваться от часа до 3 часов при комнатной температуре.

45

РНК гибридизация

19. Для детекции транскриптов удалить гибридизационный буфер, добавить в образец гибридизационную смесь с зондом(ами). Состав гибридизационной смеси можно посмотреть в разделе «Растворение зонда в гибридизационном буфере». Поставить инкубировать на ночь при комнатной температуре или при +37–42°С. Важно помнить, что длядетекциитранскриптовнеобходимоиспользоватьзонды,представляющие собой одноцепочечные молекулы! В случае использования двуцепочечных зондов, их предварительно надо денатурировать.

Постгибридизационные отмывки и заключение препарата

20.Препараты отмыть в 4×SSC при +37ºС или при комнатной температуре в течение 40 мин.

21.Образцы поместить в 1×SSC с добавлением красителя DAPI

всоотношении 1:100 в течение ночи. Или заключить препараты в фотозащитную среду с DAPI в концентрации 1мг/мл, хранить в темнотеместепри+4ºС.Дляудобствапоследующегомикроскопирования полученных образцов, заключать препараты можно в специальные камеры (как например, CoverWell imaging chamber gasket, Invitrogen).

2.6.2.

Фиксация тканей для приготовления криосрезов

1.Изолированные фрагменты тканей промыть в физиологическом растворе или 1×PBS.

2.Фиксировать материал в 4% PFA на 1×PBS от 30 мин — 4 ч до ночи при +4°С.

3.Отмыть в трех сменах 1×PBS по 5–10 мин в каждой.

4.Пропитатьсредой,которойбудутзалитыблоки,например,FSC22 Clear Frozen Section Compoud (Leica) в течение 1–2 часов при комнат-

ной температуре.

5.Залить материал в блоки и нарезать на микротоме нужной толщины. Наклеить срезы на подготовленные стекла и хранить на –20°С до использования (но не более одного месяца).

Предгибридизационные обработки

6.Дополнительно зафиксировать материал на стекле 1% PFA

втечение 10 мин при комнатной температуре.

7.Отмыть три раза по 5 мин в 1×PBS при комнатной температуре.

46

8.Обработать0,5%растворомТритонаХ-100втечение30минпри комнатной температуре.

9.Повторить пункт 7.

10.Дегидратироватьвсерииспиртовповышающейсяконцентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 5 мин в каждом.

РНК гибридизация

11. Нанести гибридизационную смесь с зондом под покровное стекло, края стекла заклеить. Поставить инкубировать на ночь при комнатной температуре или при +37–42°С.

Постгибридизационные отмывки и заключение препарата

12.Осторожно удалить резиновый клей и покровное стекло. Препараты отмыть один раз в 2×SSC и дважды в 4×SSC при +37ºС или при комнатной температуре по 5 мин каждый.

13.Поместить препараты в стакан с дистиллированной водой на 30 с для отмывки солей, далее дегидратировать в серии спиртов повышающейся концентрации (70%, 80%, 96% этанол) по 5 мин в каждом.

14.Заключить препараты в фотозащитную среду с DAPI в концентрации 1мг/мл, хранить в темноте при +4ºС.

Фиксация клеток

Прификсациикультурыклеток,выращеннойнапокровныхстеклах, отобрать среду, отмыть один раз 1×PBS, фиксировать материал в 2% или4%PFAна1×PBS10–20минприкомнатнойтемпературе.Отмыть в трех сменах 1×PBS по 5 мин в каждой.

При фиксации суспензионной культуры клеток, клетки осадить центрифугированием (180–200g 10 мин), надосадочную жидкость удалить, осадок осторожно разбить, фиксировать материал в 2% или 4% PFA на 1×PBS 10–20 мин при комнатной температуре, отмыть в трех сменах 1×PBS по 5 мин в каждой, включая этап центрифугирования клеток. Клетки нанести на поверхность обработанного стекла на 20–40 мин во влажной камере при комнатной температуре. После этоговкаплюклетокнанестификсатор(4%PFA)длядополнительной фиксацииклетокнастекле,оставитьна15–20минвовлажнойкамере при комнатной температуре. Отмыть три раза по 5 мин в 1×PBS при комнатной температуре.

47

Предгибридизационныеобработкипровести,какописановпротоколе 2.6.2 начиная с пункта 8. Время обработки тритоном можно сократить до 10–15 мин.

РНК гибридизацию и постгибридизационные отмывки и заключение препарата проводить, как описано в пункте 2.6.2.

2.6.4. • • FISH

Контрольные эксперименты приведены для протокола детекции транскриптовнакусочкахтканейиэмбрионах.Однакоихпоаналогии можно использовать и для криосрезов и фиксированных культурах клеток.

Положительный контроль (FISH по протоколу ДНК гибридизации)

1.Провести образцы по пунктам 1–18 из раздела 2.6.1.

2.Удалитьгибридизационныйбуфер,добавитьвобразецгибридизационнуюсмесьсзондом(ами).Составгибридизационнойсмесиможно посмотреть в разделе «Растворение зонда в гибридизационном буфере».

3.Поместить образец в эппендорфе в лунку термошейкера и провести совместную денатурацию ДНК образца и зонда при +80–85ºС

втечение 10–20 мин.

4.Поставить образец инкубироваться при таких же условиях, что и при РНК FISH.

5.Постгибридизационные отмывки и заключение препарата проводить, как описано в пунктах 20–21 из раздела 2.6.1.

Отрицательный контроль №1 (FISH по протоколу РНК гибридизации, но с дополнительными предобработками)

1.Провести образцы по пунктам 1–3 из раздела 2.6.1.

2.Далее провести предобработку препарата с помощью РНКазы А, как описано в протоколе А раздела 2.3, но дополнительно добавив

всмесь 0,01% Тритон Х-100 и увеличив время инкубирования до 2– 3 часов, в зависимости от объема ткани.

3.Провести образцы по пунктам 4–21 из раздела 2.6.1.

Отрицательный контроль №2 (FISH по протоколу РНК гибридизации, но с дополнительными предобработками)

1. Провести образцы по пунктам 1–3 из раздела 2.6.1.

48

2.Далее провести предобработку препарата с помощью ДНКазы, как описано в протоколе D раздела 2.3, но дополнительно добавив

всмесь 0,01% Тритон Х-100 и увеличив время инкубирования до 2– 3 часов, в зависимости от объема ткани.

3.Провести образцы по пунктам 4–21 из раздела 2.6.1.

Отрицательный контроль №3 (FISH по протоколу РНК гибридизации, но с дополнительными предобработками)

1.Провести образцы по пунктам 1–21 из раздела 2.6.1.

2.Послемикроскопирования,отмытьобразецвтрехсменах2×SSC по 5 мин в каждой при комнатной температуре.

3.Обработать образец с помощью РНКазы Н. Для этого развести ферментвбуферномрастворе,содержащим50мМTrisHCl,75мМKCl, 3мМMgCl2, 10мМ DTT, в концентрации 100 U/мкл.

4.Снова провести образцы по пункту 21 из раздела 2.6.1.

Контроль на автофлуоресценцию

1. Провести образцы по пунктам 1–21 из раздела 2.6.1, однако в гибридизационную смесь не добавлять сам зонд.

• • • • • ••• - € ‚-• •

1.Опишитепринципинтерпретациигибридизационныхпрофилей на интерфазных ядрах.

2.Какие контрольные эксперименты необходимы при проведении FISH по протоколу РНК гибридизации?

3.Опишите возможные причины отсутствия гибридизационного сигнала на препарате после проведения FISH по протоколу ДНК гибридизации.

4.Какие составы гибридизационных смесей применяют при постановке гибридизации in situ?

5.Опишите отличия при проведении FISH по протоколу ДНК

иРНК гибридизации.

2.7. ˜ 2

Протокол 1. Фотозащитная среда 1

1.К1мл0,2MTris-HCl(pH7,5)или1×PBSдобавить233мгDABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane).

2.Перемешать пипетированием.

49