Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факульте

• • • • ••• -•

••€• • • •• ••• . . . • ‚•

IN SITU

(

)

-

-

. . .

2021

ББК 28.04я73 Ф69

Печатается по решению кафедры анатомии и физиологии человека и животных РГПУ им. А. И. Герцена

Утверждено в качестве учебно-методического пособия на заседании учебно-методического совета ФГБУ НМИЦ им В. А. Алмазова

Рецензенты:

канд. биол. наук О. Г. Чиряева (Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии

и репродуктологии им. Д. О. Отта»)

канд. биол. наук А. М. Злотина (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации)

Составители:

канд. биол. наук А. Ф. Сайфитдинова

канд. биол. наук И. Л. Пуппо

Ф69 Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных

иклинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факультетов университетов). — Санкт-Петербург : Изд-во РГПУ им.А. И. Герцена, 2021. — 60 с.

ISBN 978-5-8064-2984-2

1

IN SITU

Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе свойства нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод гибридизации in situ позволяет точно определить локализацию практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке или клеточном ядре, на метафазных хромосомах, растянутых хроматиновыхфибриллахимикроматрицахблагодаряиспользованию высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Особую востребованность методы гибридизации in situ приобрели в последнее время в связи с развитием персонализированной таргетной биомедицины. В последние 30 лет технология флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) интенсивно развивалась и преобразовалась в целый комплекс методов, позволяющих получать информацию не только о физической локализации нуклеиновых кислот, но и об организации генома и кариотипа. Различают FISH на растянутых фибриллах, на метафазных хромосомах, на распластанных интерфазных ядрах и на фиксированных препаратах клеток, сохраняющих трехмерную организацию (3D-FISH). В зависимости от особенностей исследования и решаемых им задач выделяют следующие разновидности: одновременную многоцветную FISH с использованием различных зондов, многоцветную FISH с зондами к отдельным хромосомным сегментам (M-FISH), многоцветный бэндинг хромосом (MCB-FISH), хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), межвидовое цветное сегментирование хромосом (Rx-FISH), спектральное кариотипирование (SKY), супрессорную FISH в присутствии избыточного количества конкурентной ДНК (CISS), сравнительную геномную гибридизацию (CGH). Несмотря на различия отдельных протоколов, все они включают этапы денатурации меченого зонда и нуклеиновых кислот на препарате с последующей их одновременной ренатурацией двойной спирали (рис. 1).

В качестве зонда, в любой разновидности гибридизации in situ, используются фрагменты нуклеиновых кислот, в состав которых включены репортерные молекулы. Прямое мечение осуществляется

5

Рис. 1. Схема гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием меченого зонда (репортерная молекула обозначена звездочкой)

включением предшественников нуклеиновых кислот, непосредственно конъюгированных с красителем. Обычно для этого используют органическиефлуорохромынаосновехимическимодифицированных родаминов или цианинов, т. к. они обладают хорошими спектральнымихарактеристикамиистабильностьювводныхрастворах.ДляодновременноймногоцветнойFISHзондыметятфлуорохромами,спектры которых не перекрываются. В некоторых случаях, краситель вводят в

состав зонда методами твердотельного химического синтеза, однако наиболее распространены методы биохимического синтеза на основе различныхполимеразныхреакций.Длянепрямогомеченияиспользуются предшественники, несущие химические модификации, не препятствующие биохимическому синтезу нуклеиновых кислот, такие как биотин, дигоксигенин, динитрофенол, эстрадиол, а также этинил. Используют дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, связанные ковалентно с репортерной молекулой углеводородным линкером для облегчения включения такого предшественника в синтезируемый зонд. На препаратах такие репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин, динитрофенол,эстрадиол)детектируютвеществами,имеющимикним высокое сродство, например различными вариантами авидина для детекции биотина или специфичными антителами. Для визуализации используют хромогенные или флуоресцентные красители. Этинилированные предшественники выявляют проведением на препарате так называемой клик-реакции, которая происходит при комнатной температуре в водной среде в присутствии медного катализатора между этинилом в составе зонда и азидной группой, функционализирующей краситель.

Состав и размеры зондов варьируют в зависимости от целей эксперимента и особенностей метода. Последовательность, комплементар-

6

ная исследуемой, может быть представлена РНК, одно- и двунитевой ДНК, а также искусственными аналогами, или ксенонуклеиновыми кислотами, несущими в своем составе химические модификации, не существующие в природе, однако сохраняющие информационные свойства нуклеиновых кислот. Длина зонда может колебаться от 20– 40 п.н. вплоть до 1000 п.н. Каждый вариант имеет свои преимущества

инедостатки. Рассмотрим их более подробно. Чаще всего используются двунитевые ДНК зонды, устойчивые к внешним воздействиям, которые можно успешно метить различными способами, однако они требуют обязательной денатурации перед использованием. Однонитевые ДНК зонды не требуют денатурации, но если для их получения используютметодПЦРспраймеромкантисмысловойцепи,тоэффективность такой реакции значительно ниже, поскольку количество продукта увеличивается в арифметической прогрессии, тогда как при использовании двух праймеров нарастание происходит в геометрической прогрессии. Недостатком ДНК-зондов является то, что они струдомпроникаютвнутрьтолстыхобъектов.Вэтомслучаепредпочтительнее использование РНК зондов, которые получают методом транскрипции in vitro в присутствии меченых предшественников. Такие зонды имеют высокое удельное включение модифицированных предшественников, а, кроме того, позволяют легко удалять с препарата несвязавшиеся однонитевые молекулы РНК простым перевариванием РНКазой А. Однако они чувствительны к действию РНКаз на всех этапах гибридизации, что накладывает дополнительные требованиякработесними.Легкопроникаютвнутрьлюбыхобразцовиустойчивы к действию РНКаз синтетические олигонуклеотидные пробы, но из-за технологических сложностей длина их ограничена, поэтому работатьснимиприходитсяпринизкихтемпературах,иначеестьриск полностью отмыть весь зонд с препарата.

Использование в качестве зондов для FISH ксенонуклеиновых олигонуклеотидов, несущих в своем составе отдельные основания замкнутой нуклеиновой кислоты (ЗНК), которые включаются в полипептидную цепь также как и природные нуклеиновые основания, позволяетповыситьихустойчивость(рис. 2).Крометого,структурная особенность входящей в их состав замкнутой рибозы увеличивает жесткостьсахарногоостоваполимера,чтонепозволяеттакомуолигонуклеотиду сворачиваться и повышает температуру плавления дуплекса.Этосвойствопозволяетуменьшитьэффективнуюдлинузондов

иповысить специфичность гибридизации.

7

Рис. 2. Варианты основания ЗНК, в которых замыкание рибозы осуществляется с участием различных химических соединений

Практически не имеют недостатков зонды на основе пептиднонуклеиновых кислот (ПНК), которые представляют собой линейные полимеры синтетических амидов, несущих азотистые основания, связанных в цепь пептидной связью. За счет сходства по размеру с мономером нуклеиновой кислоты такие полимеры могут комплементарновзаимодействоватьсприродныминуклеиновымикислотами, однако они устойчивы к ферментам. Отсутствие отрицательного заряда оси таких полимеров дает им преимущества при формировании дуплексов с заряженными природными молекулами, благодаря чему онилегкопроникаютвткани,атакжеобладаютспособностьювзаимодействовать с двунитевой ДНК на препарате, комплементарно связываясь с одной нитью ДНК и вытесняя другую из дуплекса, что делает ненужнымпредварительнуюденатурациюДНКобразца.Однакотакие зонды нельзя получать и метить в лабораторных условиях, а заказ и приобретение их у фирм-изготовителей требует существенных материальных затрат.

В зависимости от типа мишени, зонды можно разделить на следующие группы:

•специфично окрашивающие целые хромосомы (хромосомные пэйнты),

•специфично окрашивающие отдельные плечи хромосом или хромосомные сегменты,

•маркирующие центромеры отдельных хромосом (последовательности альфа-сателлитов),

•маркирующие районы локализации других сателлитных последовательностей,

8

•окрашивающие теломерные последовательности,

•маркирующие субтеломерные районы отдельных хромосом,

•маркирующие конкретные локусы хромосом (на основе клонированных последовательностей генома, отдельных генов или их фрагментов).

Вкачестве зондов могут выступать как белок-кодирующие, так и некодирующие последовательности. В зависимости от задач исследования используют разные виды зондов или их комбинацию.

Определившись с типом зонда и выбрав подходящую метку, необходимо произвести включение меченого предшественника в состав зонда. Самым дешевым методом, позволяющим пометить любую двунитевуюДНК,являетсяметодник-трансляции.Посколькупроцесс мечения определяется одновременной работой двух ферментов — ДНКазы I, наносящей однонитевые разрывы, и ДНК полимеразы I, обладающей5’–3’экзонуклеазнойиполимеразнойактивностями,успех мечениявзначительнойстепенизависитоткачестваочисткиисходной ДНК и предварительного тестирования активности ферментов.

Концевое мечение с использованием дезоксинуклеотидил трансферазы применяется главным образом для включения радиоактивного предшественника или мечения олигонуклеотидных зондов. В настоящее время вместо этого метода чаще используют твердотельный химический синтез с включением метки на одном из концов олигонуклеотида, который дает более уверенное включение и дешевле в производстве.

Метод олигомечения со случайными праймерами основан на использовании коротких олигонуклеотидных (6–9 п.н.) затравок, с равной вероятностью отжигающихся вдоль всей денатурированной молекулы ДНК и способности фрагмента Кленова ДНК полимеразы I к 5’–3’ полимеразной активности. Он позволяет получать зонды с большей долей включения меченого предшественника, чем концевое мечениеиник-трансляция,нодлинамеченыхфрагментовможетбыть ограничена только длиной матрицы, что не всегда удобно, а, кроме того,себестоимостьзонда,полученноготакимобразом,выше.Темне менее,этотметоддостаточнопростипользуетсяпопулярностью.При необходимостимеченияэтимметодомсложныхматриц,обогащенных вторичнымиструктурами,используютизотермическийвариантэтого метода с полимеразами, обладающими геликазной активностью (например, большой субъединицы полимеразы BstI или полимеразы бактериофага Ф29). В этом случае важно осуществлять контроль

9

задлинойобразовавшихсяфрагментовипроводитьпредварительную фрагментацию матрицы химическими или физическими методами, в зависимости от особенностей нуклеотидной последовательности.

Наиболее дешевым и вместе с тем самым эффективным методом получения меченых ДНК зондов является метод ПЦР. Кроме высокой эффективности включения меченых нуклеотидов, этот метод позволяет увеличить количество исходной матрицы в среднем в 104 раз. Принеобходимостиполучитьзонддлялокализацииизвестнойпоследовательности используются праймеры, находящиеся на расстоянии 100 п.н. — 1000 п.н., не образующие шпилек и не комплементарные друг другу. При использовании в качестве матрицы геномной ДНК рекомендуется до реакции мечения получить первичный амплификат и убедиться, что его длина соответствует предполагаемой. Дополнительно желательно провести секвенирование полученного фрагмента по Сэнгеру, чтобы убедиться в его соответствии ожидаемому по нуклеотидному составу. В том случае, если необходимо получить зонд для клонированного фрагмента неизвестной нуклеотидной последовательности, можно воспользоваться стандартными праймерами, фланкирующими полилинкерный участок вектора. Необходимо помнить,чтонаилучшийрезультатполучаетсяприиспользованиизондов длиной 200–700 п.н., при этом допустимо использование последовательностей до 1000 п.н., но если клонированный фрагмент длиннее, его придется разрезать подходящей рестриктазой или ДНКазой I. Для этого готовят раствор 1,5 мкг/мл ДНКазы; 0,1M MgCl2 и добавляют прямовреакционнуюсмесьвтакомколичестве,чтобыпосле10–15мин инкубации в растворе были фрагменты длиной 200–500 п.н. Ингибируют ДНКазу прогреванием в течение 2–3 мин при 94оС.

ИспользованиеПЦРсвырожденнымипраймерамипозволяетметить любые последовательности ДНК достаточно эффективно, причем, имея даже незначительное число копий исходной ДНК-матрицы, мы можем получить неограниченное количество меченого зонда. Сначала проводят несколько низкотемпературных циклов, позволяющих праймерам фланкировать участки ДНК матрицы, причем, варьируя условия первых циклов можно задавать специфичность отжига и длину полученных фрагментов. В следующих высокотемпературных циклах полученные фланкированные последовательности амплифицируютсяпостандартномупротоколуПЦР.Меченыйпредшественник вводится в реакцию только после проверки длины первичного амплификата. 1–10 мкл исходного ПЦР продукта берут в реакцию мече-

10