Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факульте

2

ƒ ƒ FISH

Несмотря на прогресс в развитии молекулярно-генетических методов анализа и совершенствовании технологий полногеномной амплификации и секвенирования ДНК, в том числе и из единичных клеток,методFISHнеуступаетсвоихпозиций,каквдиагностических, такивнаучныхисследованиях.Вэтойглавебудутописаныосновные областипримененияметодаFISH:интерфазныйиметафазныйанализ, модификацииметода,позволяющиеисследоватьтранскриптывклетках и тканях.

Вразделе 2.1. этой главы описаны методики приготовления препаратов метафазных хромосом и интерфазных ядер из наиболее часто используемых для анализа тканей: периферической и пуповинной крови,культивируемыхфибробластов.Следуетотметить,чтоописанные методики представляют собой схемы, которые можно применять

идля других подобных клеток и тканей: представляющие собой как прикрепленныекповерхностикультуральногопластика,такисуспензионные культуры. Следует, однако, помнить, что, несмотря на единствоэтаповметодики(культивирование,обработкаколхицином, гипотоническая обработка и фиксация) — состав, концентрация и время экспозиции основных реактивов можно варьировать, в зависимости отособенностейизучаемойткани,ихследуетподбиратьэмпирически, отталкиваясь от рекомендаций фирм-производителей реактивов.

Вразделе 2.2. будут даны методики приготовления и мечения зондов.

Вразделе 2.3–2.5 описаны методики FISH по протоколу ДНК гибридизации,которыеподразумеваютдетекциюДНКнацитологическом препарате.Представленыосновныепринципыинтерпретациирезультатов после FISH по протоколу ДНК гибридизации, а также описаны возможные проблемы и пути их решения.

Вразделе 2.6 представлена модификация гибридизации in situ, позволяющаяиспользоватьметодикудлядетекциитранскриптов,как

21

мРНК,такинекодирующихбелкипоследовательностейнапрепаратах фиксированных клеток, криосрезов и целых кусочков тканей. В связи с особенностями методики в этой главе отдельно приведены протоколы фиксации тканей и клеток, а также протоколы контрольных экспериментов, необходимых для адекватной оценки полученных результатов.

В приложении будут описаны протоколы приготовления фотозащитных сред и растворов.

Особо хочется подчеркнуть, что описанные в этой главе методики можно использовать как в научных, так и в клинических исследованиях.

2.1.ƒ

IN SITU

Этап культивирования

1.В стерильных условиях в ламинарном шкафу добавить в цент- рифужнуюпробирку:средыRPMI-1640сL-глутамином4,5мл;сыво- ротки эмбриональной телячьей 0,5 мл; антибиотик 3–5 мкл; стимулятор клеточного деления фитогемаглютинин (ФГА) или конкавалин А или покивид в концентрации, рекомендованной фирмой-производи- телем; 0,3–0,5 мл гепаринизированной крови.

2.Содержимое пробирки осторожно перемешать и поставить

вштативе в термостат при +37°С на 72 часа.

Примечание

Если проводится культивирование клеток пуповинной крови плода, то необходимо предварительно перед постановкой культуры клеток провести контроль на контаминацию образца материнскими клетками,которыйоснованнаразницефетальногоивзрослогогемоглобина. Для этого в пробирку с 5 мл дистиллированной воды добавляют 1,0 мл 0,25N NaOH и 0,05 мл крови (1–2 капли). Перемешивают содержимое покачиванием пробирки в течение примерно 1 мин. Смена цвета от розового до темного зелено-коричневого свидетельствует о присутствии в образце контаминации материнской крови.

22

Этап обработки колхицином

3. По окончании времени культивирования в каждую пробирку добавить колхицин или колцемид в концентрации, рекомендованной фирмой-производителем, осторожно перемешать содержимое флакона и оставить в термостате при +37°С на 40–60 мин.

Примечание

Время обработки колхицином для других культур клеток или тканейподбираетсяэмпирическипооценкечислаикачестваметафазных пластинок. Хромосомы в метафазной пластинке не должны быть слишком конденсированными (короткими). Также следует помнить, что на больший объем клеток (тканей) может потребоваться большая концентрация колхицина или колцемида.

Этап гипотонической обработки

4.Клетки осадить центрифугированием при 180–200g 10 мин.

5.Надосадочнуюжидкостьудалить,оставляя0,3-–0,5млнадосад- ком. Осадок разбить.

6.Струйно добавить 5 мл гипотонического раствора (0,55% KCl), перемешать и инкубировать 15–20 мин при комнатной температуре.

Примечание

Гипотонический раствор готовить в день эксперимента. Гипотоническую обработку можно проводить в термостате при температуре +37°С. В качестве гипотонического раствора могут быть использованы 0,9% цитрат натрия или 1% хлорид калия или смесь 0,9% цитрата натрия и 1% хлорида калия в соотношении 1:1. Для каждого типа клеток/ткани состав и концентрация гипотонического раствора подбирается эмпирически.

Этап префиксации

7.Добавить по 0,5 мл холодного фиксатора, перемешать и сразу же осадить центрифугированием (10 мин, 180–200g).

8.Повторить пункт 5.

Примечание

Этот этап можно пропустить и сразу перейти к фиксации. Однако отмечено, что для многих типов тканей и клеточных культур этап префиксации помогает улучшать качество препаратов метафазных хромосом.

23

Этап фиксации

9.В пробирку добавить по 5 мл холодного фиксатора (3 части метанола + 1 часть ледяной уксусной кислоты). Хорошо перемешать, оставить при +4°С в течение 20–30 мин.

10.Провести две-три смены фиксатора, каждый раз осаждая клетки центрифугированием и повторяя п. 5.

11.Нанести суспензию клеток с высоты на поверхность мокрого охлажденного стекла.

12.Высушить препараты на воздухе.

13.По завершении работы в каждую пробирку добавить по 3–5 мл фиксатора и поставить на хранение на +4°С (для непродолжительного хранения) или на –20°С (для более длительного хранения).

Примечание

Раствор фиксатора готовить в день эксперимента. Вместо метанола можно использовать абсолютный этанол.

2.1.2.

Этап культивирования

1.Образцы дермы механически измельчить с помощью маникюрных ножниц.

2.Провестиферментативнуюобработкуполученныхмелкихфрагментов ткани в течение 1,5 часов в 0,1% растворе коллагеназы 1 типа, разведенной в соответствии с инструкцией фирмы-производителя

в1×PBS при температуре +37°С и постоянном перемешивании

вшейкере-инкубаторе.

3.Нейтрализовать коллагеназу питательной средой МЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

4.Полученные фрагменты ткани высеивать в среду МЕМ с добавлением20%эмбриональнойтелячьейсыворотки,пенициллина,стрептомицина и фунгизона на флаконы площадью 75 см2. Концентрацию антибиотиков добавлять в соответствии с рекомендациями фирмыпроизводителя.

5.Через два-четыре дня во флаконах должны наблюдаться прикрепленные к пластику веретенообразные клетки, после чего можно провести смену среды на свежую (МЕМ с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина и стрептомицина).

24

6. Через три дня провести пассирование культуры. Для этого отобрать среду из флакона, промыть клетки раствором теплого Версена (+37°С),добавитьвофлакон2–3млтеплого0,25%трипсина,поставить культуральный планшет в термостат на +37°С. Через две-три минуты отобрать полученную суспензию клеток, распределить во флаконы со средой.

Этап обработки колхицином

7.За 35–60 мин до окончания культивирования ввести в среду колхицин в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Содержимое осторожно перемешать.

8.Удалить среду культивирования, промыть клетки средой Хэнкса или 1×PBS или Версена, добавить 2–3 мл 0,25% трипсина

ипоставить культуральные планшеты в термостат на +37°С.

9.Перенестиклеткиспомощьюпипеткивцентрифужнуюпробирку и собрать центрифугированием при 180–200g в течение 5–10 мин. Надосадочную жидкость удалить, оставляя 0,3–0,5 мл над осадком, осадок осторожно пипетировать.

Этап гипотонической обработки

10. Инкубировать в 5–8 мл теплого гипотонического раствора

(0,55% KCl, +37°С) 20–30 мин.

Этап префиксации

11.Добавить100–500мклсвежеприготовленногофиксатора(3 части метанола+1 часть ледяной уксусной кислоты) в пробирку с гипотоническим раствором.

12.Клетки собрать центрифугированием при 180–200g в течение 5–10 мин. Надосадочную жидкость удалить, оставляя 0,3–0,5 мл над осадком, осадок осторожно пипетировать.

Этап фиксации

13.Добавитьвпробирку5–8млохлажденногофиксатораиоставить на 30 мин при –20°С.

14.Повторить пункт 9.

15.Повторить этап смены фиксатора 3–4 раза.

16.Чистые сухие предметные стекла поместить в 96% этанол

иохладить до +4°С.

25

17.Промытьпредметноестекловледянойдистиллированнойводе

ираскапать на него суспензию фиксированных клеток. Высушить препараты на воздухе.

В случае, если вы используете некоммерческие зонды, то перед проведением самой гибридизации in situ, можно воспользоваться одним из протоколов приготовления зондов.

2.2.1. 1. - -

Необходимые растворы

•10х буфер NT: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 50мМ MgCl2; 0,5 мг/мл БСА.

•100мМбета-меркаптоэтанол:0,1млбета-меркаптоэтанолараство- рить в 1,4 мл бидистиллированной воды.

•Смесь нуклеотидов: 0,5мМ dATP, 0,5мМ dCTP, 0,5мМ dGTP и 0,1мМ dTTP.

•Раствор меченого нуклеотида: 1мМ dUTP.

•Концентрированный раствор ДНКазы I: 1 мг/мл, растворить 1 мг в 0,5 мл 0,3М NaCl, добавить 0,5 мл глицерина, разделить на порции и хранить при –20°С.

•Рабочий раствор ДНКазы I: 1 мкг/мл в воде, готовят непосредственно перед использованием (концентрацию фермента в рабочем растворе лучше подобрать заранее, см протокол 7 в разделе Приложений).

•Останавливающий реакцию раствор: 0,1М NaCl; 20мМ ЭДТА; 20мМ Tris-HCl (pH7,5).

Протокол 1. В центрифужной микропробирке собрать реакционную смесь:

1 мкг ДНК

5 мкл 0,1М бета-меркаптоэтанола

5 мкл смеси нуклеотидов

5 мкл 10х буфера NT

1 мкл 1мМ меченого dUTP H2O до 48 мкл

26

2.Быстро перемешать на вортексе и поставить в лёд.

3.Добавить 1 мкл ДНК полимеразы I (5 единиц) и 1 мкл рабочего раствора ДНКазы I, быстро перемешать и собрать смесь кратковременным центрифугированием.

4.Инкубировать 90 мин при +15°С.

5.Отобрать 10 мкл реакционной смеси для исследования методом электрофореза в 1,2% агарозном геле, остальную смесь поставить

влёд.

6.Если длина фрагментов больше 1000 п.н., то продолжить инкубировать при +15°С еще 30 мин.

7.Остановить реакцию добавлением равного объема (40 мкл) останавливающего буфера.

8.Добавить в реакционную смесь ДНК носитель (количество носителя и его выбор зависит от целей эксперимента и будет описан ниже) и 1/10 объёма 3М ацетата натрия, рН 5,5.

9.Добавить 2,5 объема этанола и хранить при –20°С до использования (осаждать в этаноле как минимум в течение ночи).

10.Перед использованием осадить ДНК центрифугированием при 12 000g в течение 15 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением, +4°С).

11.Промыть осадок 70% этанолом и подсушить.

2.2.2. 2. •

Необходимые растворы

•10х буфер NT: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 50мМ MgCl2; 0,5 мг/мл БСА.

•100мМбета-меркаптоэтанол:0,1млбета-меркаптоэтанолараство- рить в 1,4 мл бидистиллированной воды.

•Смесь нуклеотидов: 0,5мМ dATP, 0,5мМ dCTP, 0,5мМ dGTP

и0,5мМ dTTP.

•Концентрированный раствор ДНКазы I: 1 мг/мл, растворить 1 мг в0,5мл0,3МNaCl,добавить0,5млглицерина,разделитьнапорции

ихранить при –20°С.

•Рабочий раствор ДНКазы I: приготовить серию разведений от 0,1 мкг/мл до 10 мкг/мл в воде.

•Останавливающий реакцию раствор: 0,1М NaCl; 20мМ ЭДТА; 20мМ Tris-HCl (pH 7,5).

27

Протокол

1.В центрифужных микропробирках собрать реакционную смесь:

1 мкг ДНК

5 мкл 0,1М бета-меркаптоэтанола

5 мкл смеси нуклеотидов

5 мкл 10х буфера NT H2O до 48 мкл

2.Быстро перемешать на вортексе и поставить в лёд.

3.Добавить 1 мкл ДНК полимеразы I (5 единиц) и по 1 мкл каждогорабочегораствораДНКазыI,быстроперемешатьисобратьсмесь кратковременным центрифугированием.

4.Инкубировать 90 мин при +15°С.

5.Отобрать 10 мкл реакционной смеси для исследования методом электрофореза в 1,2% агарозном геле с маркерами размера ДНК от 50 до 2000 п.н.

6.Зафиксировать оптимальную концентрацию рабочего раствора, дающую фрагменты от 100 до 500 п.н., и использовать ее в дальнейшем.

2.2.3. 3. •

Необходимые растворы

•10х буфер для фрагмента Кленова: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 100мМ

MgCl2; 10мМ DTT; 0,5 мг/мл БСА; 0,5М ЭДТА (pH 8,0).

•10х смесь праймеров: 1мМ раствор олигонуклеотидов (статистических затравок).

•10хсмесьнуклеотидов:1мМdATP;1мМdCTP;1мМdGTP;0,65мМ dTTP и 0,35мМ меченого dUTP.

Протокол

1.МатричнуюДНК,раствореннуювводе,прокипятитьнаводяной бане в течение 5 мин и быстро перенести на лёд.

2.Собрать реакционную смесь:

0,5–1 мкг денатурированной ДНК 2 мкл 10х буфера 2 мкл смеси нуклеотидов

2 мкл смеси праймеров H2O до 19 мкл

28

3.Добавить 2 мкл фрагмента Кленова (2 единицы), перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным центрифугированием.

4.Инкубировать при +37°С от 2 до 8 часов.

5.Остановить реакцию добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА.

6.Отобрать5–10мклреакционнойсмесидляисследованияметодом электрофореза в 1,2% агарозном геле.

7.Добавить в реакционную смесь ДНК носитель (количество носителя и его выбор зависит от целей эксперимента и будет описан ниже) и 1/10 объёма 3М ацетата натрия, рН 5,5.

8.Добавить 2,5 объема этанола и хранить при –20°С до использования (осаждать в этаноле как минимум в течение ночи).

9.Перед использованием осадить ДНК центрифугированием при 12 000g в течение 15 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением, +4°С).

10.Промыть осадок 70% этанолом и подсушить.

2.2.4. 4. ••

Необходимые растворы

•10х буфер для Taq полимеразы: 0,1М Tris-HCl (pH 8,4); 0,5М KCl;

25мМ MgCl2 (лучше использовать буфер, рекомендованный производителемполимеразы,концентрацияMgCl2 можетбытьот15мМ до 25мМ).

•10х раствор прямого праймера: 10 мкМ.

•10х раствор обратного праймера: 10 мкМ.

•10хсмесьнуклеотидов:2мМdATP;2мМdCTP;2мМdGTP;1,3мМ dTTP.

•Меченый предшественник: 1мМ меченый dUTP. Протокол

1.Собрать реакционную смесь в тонкостенной микропробирке для ПЦР:

2 мкл 10х буфера

2 мкл 10х смеси нуклеотидов

1,4 мкл 1мМ меченого dUTP

2 мкл раствора прямого праймера

2 мкл раствора обратного праймера

1 единицу Taq ДНК полимеразы

0,1 мкг ДНК матрицы Н2О до 20 мкл

29

2.Быстро перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным центрифугированием.

3.При необходимости наслоить минеральное масло (если термоциклер оборудован нагревающейся крышкой — эта процедура не нужна).

4.Инкубировать в термоциклере по следующей программе:

Температура отжига зависит от длины и состава праймеров. Температура синтеза зависит от используемой полимеразы.

5. Отобрать 0,5–1 мкл реакционной смеси для исследования методом электрофореза в 1% агарозном геле.

Включение dUTP, меченных некоторыми флуорохромами, требуетуменьшениядолимодифицированногонуклеотидаисоответственно увеличения доли dTTP в реакционной смеси. Конечная концентрация некоторых конъюгатов:

При подборе оптимального соотношения модифицированного предшественника с немодифицированным в реакционной смеси рекомендуется отталкиваться от рекомендаций производителя.

2.2.5. 5. • ••

Необходимые растворы

•Хлороформ—изоамиловыйспирт:смешатьхлороформиизоами- ловый спирт в соотношении 24:1.

30