9. Экстракция образца в трет-бутаноле (Метод в)

В 2 пробирки с 10 мл супернатанта добавляли по 10 мл трет-бутанола, затем по 1,5 г (NH₄)₂SO₄ и откручивали на вортексе 30 с, отстаивали 5 минут до начала разделения фаз. Центрифугировали на 1500 g 10 мин. Фазы разделили. К водным ( 7,5 мл) добавляли по 15 мл трет-бутанола и 2,25 г (NH₄)₂SO₄, откручивали на вортексе 2 мин, отстаивали 5 мин и озвучивали на УЗ-бане 15 мин при 32°C, до получения визуально однородной смеси. Центрифугировали 10 мин на 1500 g. Фазы разделили, интерфазу раствори в буфере С и воде.

Таблица 8. Контроль флуоресценции в процессе очистки методом В.

Фракция	Буфер+соль+трет	Водная фаза, не обработ	Орг фаза	Пленка на разделе фаз желт
Результат проверки	GFP да/нет	Да	Да, мало	Нет
Фракция	трет+соль	Водная фаза, не обраб	Орг фаза	Пленка ярко-желтая
Результат проверки	GFP да/нет	Да	Да	Да очень
Фракция	Добавили буфер С к пленкам*	Пленка 1*		Плёнка 2*
		Объединили и довели до 5 мл*
Результат проверки	Да	Да

*Фракции, полученные в процессе растворения целевого осадка после очистки

10. ВЭЖХ

Анализ проводили со скоростью 1 мл/мин. Уравновесили колонку буфером А. Нанесли 80 мкл образца на колонку. Использовали режим линейного градиента: первоначально буфер Б 20% и буфер А 70%, далее буфер Б 70 %, буфер А 20% (контролировали перепад давления в колонке), время анализа 20 мин. Промыли колонку буфером Б и буфером для хранения.

11. Количественное определение белков методом Брэдфорда

Для градуировочного графика приготовили сток-раствор бычьего сывороточного альбумина (2 мг/мл) 2 мг твёрдого вещества растворили в 1 мл дист. воды. Подготовили эппендорфы с 30 мкл дист. воды. Отобрали аликвоту 30 мкл БСА и растворили в 1 эппендорфе, далее сделали раститровку по 30 мкл 6 раз. В каждый образец добавляли 1 мл реактива Брэдфорда и 5 мл дист. воды. Оптическую плотность снимали на спектрофотометре при длине волны 595 нм.

По градировочному графику определили концентрации белка в пробах после очистки, результаты отражены в табл. 4.

12. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия

Белковые пробы анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. К 20 мкл соответствующего раствора белка добавили по 20 мкл красителя(2x раствор Лэммли для проб для электрофореза [2x SDS раствор для проб]). Пробы в эппендорфах перемешали на вортексе и осадили в центрифуге. Затем пробы прогрели в термостате при 95℃ в течение 15 минут. После этого пробы снова перемешали на вортексе и центрифугировали. В качестве верхнего электродного буфера использовали 1x трис-глициновый буфер (25 mM Трис, 192 mM глицин, 0.1% SDS, pH 8.3). Для входа проб в разделяющий гель использовали напряжение 90 В в течение 15 минут. Далее повышали напряжение до 180 В и проводили электрофорез в течение 2 часов.

Для фиксирования полос на геле добавили фиксирующий раствор (45% этанол, 10% ледяная уксусная кислота, 45% деионизованная вода) на 15 минут. Фиксирующий раствор слили и добавили раствор для покраски (0,25% кумасси бриллиантовый синий, 10% ледяная уксусная кислота, 25% изопропанол, 80% деионизованная вода) на 15 минут. Краситель декантировали и добавили раствор для отмывки (10% ледяная уксусная кислота, 10% изопропанол, 80% деионизованная вода) на 10 минут. Раствор слили, добавили свежую отмывку и оставили гель на ночь отмываться в холодильнике на +4℃.