Определение концентрации с использованием реактива Брэдфорда
Для определения концентрации GFP в выделенных фракциях нами, по стандартной методике [3] был построен градуировочный график (Рис.13). Метод был выбран из-за простоты воспроизведения, доступности реагентов, а также из-за того, что метод Брэдфорда является наиболее точным среди других методик. Градуировочная прямая имеет коэффициент корреляции 0,97, что позволяет довольно точно определить концентрацию белка при измерении оптической плотности, по аналогии с измерениями для самой градуировочной прямой. Для полученных образцов максимальную концентрацию имеет «1 экстр» - образец сразу после лизиса биомассы, высокая концентрация в остальных образцах кроме 5А и 5В, вероятно вызвана присутствием примесных белков, так как флуоресценции в данных образцах нет. В целевых образцах 5А и 5В концентрация GFP высокая, в образце 5В она на несколько сотых выше. Результаты представлены в табл. 4.
Рисунок 13. Градуировка с определением концентраций целевых проб.
Таблица 4. Оптическая плотность и соответствующие значения концентраций белковых компонентов в образцах.
|
1 экстр |
ВВ |
3В |
2В |
4В |
5В |
5А |
ОП1 |
0,522 |
0,452 |
0,429 |
0,404 |
0,402 |
0,407 |
0,405 |
Конц белковых компонентов мг/мл |
1,44 |
0,96 |
0,79 |
0,61 |
0,59 |
0,64 |
0,62 |
Анализ спектров поглощения и испускания полученных растворов gfp
С использованием спектрофлуориметра были получены спектры поглощения (Рис. 14) и испускания (Рис. 15) для фракций 5A и 5В.
Рисунок 14. Спектры поглощения растворов 5A и 5B. В УФ области наблюдается сильное поглощение, поскольку раствор GFP загрязнён примесными белками. Максимум поглощения в видимой области находится на 480 нм.
Рисунок 15. Спектры испускания растворов 5A и 5B. Длина волны возбуждающего света – 480 нм. Максимум интенсивности флуоресценции находится на 504 нм.
При анализе литературных данных, нами было установлено, что полученные результаты не соответствуют характеристикам, указанным для нативного GFP. Было найдено, что наши экспериментальные данные сопоставимы с характеристиками aceGFP [1,4]. Спектры поглощения и флуоресценции aceGFP представлены на Рис. 16.
Рисунок 16. Спектр поглощения (прерывистая линия) и спектр испускания (сплошная линия) aceGFP [4].
У нативного GFP два максимума поглощения на длинах волн 395 нм и 475 нм, испускания – на 510 нм. А у aceGFP только один максимум поглощения на 480 нм, и максимум испускания – на 505 нм. Выделенный нами белок имел максимум поглощения на длине волны 480 нм и максимум испускания на 504 нм, что, вероятно, говорит о том, что выделенный белок – это aceGFP.
Заметим, что в растворе 5A примерно в 10 раз меньше зелёного флуоресцентного белка, чем в растворе 5B: поглощение на 480 нм меньше в 12 раз, а интенсивность флуоресценции на 504 нм меньше в 10 раз.