Денатурация и ренатурация

При нагревании до 76°С интенсивность флуоресценции падает. Ренатурация после нагревания идет плохо.

Действие кислот (pH=1), оснований (pH=13), 6M гидрохлорида гуанидина и 8M мочевины также приводит к денатурации, однако ренатурация протекает быстро (половина молекул белка ренатурирует за десятки секунд) и ренатурировать может до 80% белка. GFP легче ренатурирует из основной среды, чем из кислой. Поскольку подавляется протонирование аминогрупп, что приводит к снижению электростатических отталкиваний и облегчает сворачивание белка.

В умеренной концентрации (0,1 мг/мл) ни одна из протеаз (трипсин, химотрипсин, термолизин, эластаза, фицин, протеиназа К, химопапаин, папаин, субтилизин, панкреатин, бромелаин и проназа) не оказывает никакого воздействия на флуоресценцию GFP, даже при инкубации в оптимальных условиях в течение 24 ч. В более высокой концентрации (43 мг/мл) при 60-часовой инкубации только бромелаин и проназа оказались способными заметно снизить флуоресценцию белка. GFP настолько стабилен, что может сохраняться на протяжении месяцев в буферном растворе при комнатной температуре без добавления противомикробных агентов, несмотря на сильную контаминацию бактериями и грибами.

Все смешивающиеся с водой растворители, даже глицерин, вызывают сдвиг поглощения природного GFP. При этом интенсивность поглощения на 395 нм падает, а на 475 нм – возрастает в несколько раз, что говорит об изменении электронной структуры хромофора. Варианты S65T и Mut 1 (EGFP) не претерпевают подобных изменений. При повышении концентрации растворителя выше 60% дальнейших сдвигов поглощения не наблюдается, а интенсивность поглощения падает, что говорит о денатурации белка.

Спектральные свойства GFP никак не изменяются под действием широкого набора анионных, катионных, цвиттерионных и неионогенных ПАВ (например, SDS, CHAPS, CTAB, Tween 80, и Triton X-100), а также хаотропных агентов (8М мочевина, 4М гидрохлорид гуанидина, 1М тиоцианат гуанидина) при комнатной температуре. При нагревании выше 40°С в присутствии ПАВ или хаотропов и белок постепенно денатурирует.

Результаты и обсуждения

1. Выделение gfp из е. Coli

При изучении методик разрушения клеточной структуры по литературным источникам были подобраны условия, доступные к воспроизведению в нашей лаборатории. С учетом имеющегося лабораторного оборудования, веществ и материалов, была выбрана методика многократной заморозки-разморозки биомассы клеток.

Количество циклов было подобрано заранее с использованием микроскопии, результаты которой представлены на Рис 3. На изображении после однократной «заморозки-разморозки» видно сплошную субстанцию без включения в ней клеточных структур, что может свидетельствовать о том, что микроорганизмы были успешно разрушены. Для повышения эффективности процесс проводили в 2 этапа и впоследствии проверяли дополнительным двукратным повтором на меньшем объеме биологического осадка. Процесс контролировали наличием флуоресценции в интересующих нас образцах (Рис. 4) и последующим анализом с использованием ВЭЖХ (Рис. 5).

Рисунок 3. Оценка протекания процесса выделения GFP из структуры E. coli, окрашивание проведено кристаллическим фиолетовым [2].

На Рис. 4 наблюдается падение степени интенсивности зеленого свечения в растворе от образца после первого выделения к третьему. Это говорит о том, что основная часть белка выделена на первом этапе лизиса клеточной биомассы и проведение более одного цикла «заморозки-разморозки» нецелесообразно.

Рисунок 4. Контроль наличия флуоресценции в образцах после однократного, двукратного и трехкратного процесса «заморозки-разморозки» с использованием лазерного луча.

Рисунок 5. Хроматограммы экстрактов после лизиса клеточной массы детекция при 395 нм.

На Рис. 5 представлены результаты анализа образцов после процесса «заморозки-разморозки» с использованием ВЭЖХ с UV-детекцией при длине волны 395 нм. При детекции на 280 нм основной пик, принадлежащий примесным белкам выходит со второй по пятую минуту. Целевое соединение выходит с колонки на 9 минуте. На хроматограммах видно, что концентрация увеличивается пропорционально от образца после трехкратного выделения к однократному. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты анализа степени извлечения GFP в экстракт в зависимости от количества циклов процесса.

ВЭЖХ GFP с детекцией 395 нм	1 экстракт	2 экстракт	3 экстракт
S Пика GFP	37,69	6,98	1,12
ВЭЖХ GFP с детекцией 280 нм	1 экстракт	2 экстракт	3 экстракт
S всех пиков	34,09	11,77	23,17
S Пика GFP	8,86	0,85	1,24
Доля GFP в образце	0,26	0,07	0,05

Содержание GFP и его доля среди всех присутствующих компонентов значительно падает после первого этапа выделения, что свидетельствует о достаточной степени извлечения белка из клеточной массы уже после первого этапа экстракции.