13. Спектральный анализ

Для снятия спектра поглощения и спектра испускания использовали раствор сравнения (буфер для хранения белка) и раствор белка 5A и 5B. На спектрофлуориметре СМ 2203 был снят спектр поглощения в диапазоне длин волн 200-900 нм. Спектр флуоресценции получали путём возбуждения флуоресцении на длине волны 480 нм и записи спектра испускания в диапазоне длин волн 400-750 нм (была вставлена высокая чувствительность ФЭУ).

14. Перебуферивание образцов методом ультрафильтрации

Образцы перенесли в центрифужные фильтры, уравновешивали буфером С и центрифугировали 10000g по 5 минут два раза. Далее добавляли буфер для хранения и ресуспендировали осадок с фильтра пипетированием, далее в эппендорфах на 2 мл центрифугировали 10 мин при 12000g.

Вывод

С целью выделение GFP из биомассы Е. сoli. были изучены литературные источники, позволяющие понять структуру и функции зеленого флуоресцентного белка. На основе понимания особенностей строения и свойств зеленого фуоресцентного белка, а также на базе проведенных и опубликованных ранее экспериментальных работ была подобрана методика выделения, очистки GFP из клеточной биомассы. На основе проанализированных данных был выделен целевой белок. Сделана оценка полученных результатов, которая свидетельствует о том, что GFP присутствует во всех образцах, однако в ходе работы было обнаружено, что выделяемый нами белок имеет молекулярную массу 46 кДа и спектры поглощения и испускания, характерные для aceGFP.

Также наблюдается наличие примесных веществ в образцах после очистки обоими методами, что можно объяснить отличием свойств выделяемого нами белка от GFP. Более благоприятная картина по разнообразию присутствующих загрязнений наблюдается при использовании метода А, но низкое содержания целевого белка не позволяет считать этот метод более пригодным.

Список литературы

1. A colourless green fluorescent protein homologue from the non-fluorescent hydromedusa Aequorea coerulescens and its fluorescent mutants. / N. G. Gurskaya, A. F. Fradkov, N. I. Pounkova [и др.] // Biochemical Journal. – 2003. – Т. 373. – № Pt 2. – С. 403-408.

2. Gram-positive bacteria - Stock Image - C001/4060. – URL: https://www.sciencephoto.com/media/78462/view/gram-positive-bacteria (date accessed: 15.12.2024).

3. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation / N. J. Kruger. – Text : electronic // The Protein Protocols Handbook : Springer Protocols Handbooks / ed. J. M. Walker. – Totowa, NJ : Humana Press, 2009. – P. 17-24. – URL: http://link.springer.com/10.1007/978-1-59745-198-7_4 (date accessed: 11.12.2024).

4. Structural Evidence for a Dehydrated Intermediate in Green Fluorescent Protein Chromophore Biosynthesis♦ / N. V. Pletneva, V. Z. Pletnev, K. A. Lukyanov [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. – 2010. – Vol. 285. – № 21. – P. 15978-15984.

5. Jain, S. Purification of recombinant green fluorescent protein by three-phase partitioning / S. Jain, R. Singh, M. N. Gupta // Journal of Chromatography. A. – 2004. – Т. 1035. – № 1. – С. 83-86.

6. Universal and rapid method for purification of GFP-like proteins by the ethanol extraction / O. N. Samarkina, A. G. Popova, E. Y. Gvozdik [и др.] // Protein Expression and Purification. – 2009. – Т. 65. – № 1. – С. 108-113.

7. Ward, W. W. Biochemical and physical properties of green fluorescent protein / W. W. Ward // Methods of Biochemical Analysis. – 2006. – Т. 47. – С. 39-65.

8. Image Lab Software | Bio-Rad. – URL: https://www.bio-rad.com/ru-ru/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z (дата обращения: 15.12.2024).