Анализ фракций после очистки aceGfp с помощью электрофореза
Анализ фракций aceGFP был проведён с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующим проявлением с использованием красителя кумасси бриллиантового синего. Результаты представлены на Рис. 17.
Рисунок 17. Анализ фракций после выделения и очистки aceGFP из биомассы Е. coli. 1 – Э-лизат, ВВ – водная фракция после первой экстракции методом В, М – маркер молекулярных масс, 5А – целевая фракция после очистки методом А, 5В – целевая фракция после очистки методом В, 3В – водная фракция после второй экстракции методом В, 2В и 4В – спиртовые фракции после первой и второй экстракции методом В. Анализ электрофореза проводился в программе Image Lab Software 6.1 [8].
Поскольку нам неизвестна молекулярная масса выделяемого белка, то определяли целевой белок на геле исходя из того, что в пробе 5А его должно быть в 10 раз меньше, чем в 5 В:
Полоса на 46 кДа присутствует и в 5А, и в 5B. Интенсивность полос отличается примерно в 8-10 раз (чистота в 5А составляет 2,8%, а чистота в 5B - 23,3%). Вероятно, это наша полоса. Поскольку масса aceGFP примерно 27 кДа, а масса белка по электрофорезу 46 кДа, то мы имеем дело с белком, состоящим из фрагмента массой 27 кДа и фрагмента белка с массой 19 кДа. Сложно сказать, какой фрагмент белка пришит к aceGFP.
По чистоте целевого белка в каждой фракции и общей концентрации белка, определённой по методу Брэдфорда, была рассчитана концентрация целевого белка в каждой фракции (произведение чистоты на общую концентрацию белка) (Табл. 5).
Таблица 5. Концентрация целевого белка в каждой фракции.
Номер фракции |
Чистота aceGFP, % |
Концентрация белка общая, мг/мл |
Концентрация aceGFP, мг/мл |
1Э |
20,3 |
1,44 |
0,292 |
ВВ |
17,8 |
0,96 |
0,171 |
5А |
2,8 |
0,62 |
0,017 |
5В |
23,3 |
0,64 |
0,149 |
3В |
19,9 |
0,79 |
0,157 |
Таблица 6. Результаты очистки и выделения целевого белка.
Номер фракции |
Концентрация aceGFP, мг/мл |
Объём раствора, мл |
Масса aceGFP, мг |
Выход, % |
1Э |
0,292 |
53 |
15,49 |
- |
5А |
0,017 |
5 |
0,09 |
0,56 |
5B |
0,149 |
6 |
0,89 |
5,78 |
Таким образом, очистка целевого белка прошла недостаточно. Чистота целевого белка практически не увеличилась, а потери белка существенны. Однако неудачную очистку можно объяснить тем, что мы выделяли белок с другими физико-химическими свойствами: мы выделяли не GFP, а конструкцию, по спектру флуоресценции и фрагмента молекулярной массой 19 кДа.
Материалы и методы
Биомасса
Клеточная биомасса Е. coli, трансформированная конструкциями, экспрессирующими GFP.
Приборы
В работе было использовано оборудование: система водоподготовки Milli Q (Millipore, Франция); весы аналитические «OHAUS Explorer Pro (OHAUS Corporation, Швейцария); весы технические ACCULAB V-200 (ACCULAB Sartorius Group, США); высокоскоростная центрифуга MSE High speed 18 (MSE, Англия); высокоскоростная центрифуга (ультрацентрифуга) Beckman L5-50 (Beckman Coulter, США); поликарбонатный мембранный фильтр Nuclepore с диаметром пор 0,2 мкм (Whatman, Англия); центрифуга MiniSpin Plus (Eppendorf, Германия); просвечивающий электронный микроскоп Olympus CX31 (Olympus, Япония); спектрофлуориметр СМ 2203 (Testo, Германия); морозильная камера DW-80WZ15 (Haier, Германия); камера для электрофореза вертикальная Mini-PROTEAN (Bio-rad, США); ультразвуковая ванна Сапфир - 2,8 ТТЦ (Сапфир, Россия); смеситель вортекс MX-S (DLAB, Китай); хроматограф, колонка хроматографическая Jupiter 5мкм C18 300А 250х4.6мм (Рhenomenex, США)