3. Материалы

В работе применялись реактивы: Трис(гидроксиметил)аминометан, Tris-base, NH₂C(CH₂OH)₃ (Sigma-Aldrich, США); натрий хлористый, NaCl (Химмед, Россия); додецилсульфат натрия, SDS, C₁₂H₂₅NaO₄S (Panreac, Испания); N,N-метилен-бис-акриламид (Amresco, США); акриламид перекристаллизованный, C₃H₅NO (AppliChem, Германия); соляная кислота, HCl (Panreac, Испания); глицерин (Panreac, Испания); мочевина (Sigma-Aldrich, США); аммония сульфат, (NH₄)₂SO₄ (Serva, Германия); бромфеноловый синий (Sigma-Aldrich, США); краситель Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva, Германия); изопропиловый спирт (Panreac, Испания); уксусная кислота (Panreac, Испания); ТЕМЕД, N,N,N´,N´-тетраметилэтилендиамин (Sigma-Aldrich, США); этиловый спирт (Химмед, Россия); бычий сывороточный альбумин (Sigma, США); глутаровый альдегид (Panreac, Испания); ацетонитрил, C2H3N (Sigma, США); КOH (Компонент-Реактив, Россия); n-бутанол (Химмед, Россия); ЭДТА, этилендиаминтетрауксусная кислота  кислота, [CH₂N(CH₂CO₂H)₂]₂ (Sigma- Aldrich, США); глицин (Serva, Германия); аммония персульфат, APS, (NH₄)₂S₂O₈ (Serva, Германия); деионизированная вода Milli Q (Millipore, CША); белковые маркеры молекулярной массы Unstained Protein Molecular Weight Marker (MBI Fermentas, Литва).

4. Методики приготовления буферных растворов.

   1. Приготовление Буфера с

Навеску веществ: NaCl 2,19 г, трис 0,61 г, ЭДТА 0,47, растворили в 54 мл дистиллированной водой, на магнитной мешалке довели рН до 8.0, добавляя по каплям HCl. Дистиллированной водой довели объем до 250 мл.

2. Насыщенный раствор сульфата аммония

Навеску сульфата аммония массой 192 г растворили в 200 мл дистиллированной воды, оставив кристаллы. Полученный раствор перенесли в мерную колбу на 200 мл.

3. 5М р-р NaCl

Навеску 14.61 г NaCl перенесли в мерную колбу на 50 мл, растворяли в дистиллированной воде, доводили до метки. Затем раствор профильтровали от примесей через ватный фильтр в фалькон объемом 50 мл.

4. Буфер хранения: PBS + 20% глицерина

Одну таблетку PBS (0,01 М фосфатно-солевой состав) растворили в 100 мл воды. Затем добавили 160 мл дистиллированной воды и 40 мл глицерина, разбавляя раствор до концентрации 0,005 М.

5. Приготовление геля для электрофореза полиакриламидном геле

Для приготовления 12% разрешающего геля (на 2 шт.) в химическом стакане на 100 мл смешали 10,06 мл воды, 12 мл акриламида и бисакриламида, 7,5 мл буфера С доведенного до рН 8,8 при помощи 1М гидроксида натрия, 300 мкл додецилсульфата натрия, 15 мкл тетраметилэтилендиамина и 150 мкл аммония персульфата немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Наслаивают на гель этанол. Оставили гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.

После окончания полимеризации этанол сливали и промывали верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и этанола. Удаляли любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.

Для приготовления 4% концентрирующего геля (на 2 шт) в химическом стакане на 100 мл смешали 12 мл воды, раствор акриламида и бисакриламида, 8 мл буфера С доведенного до рН 6,8 при помощи 1М соляной кислоты, 200 мкл додецилсульфата натрия, 10 мкл тетраметилэтилендиамина и 100 мкл аммония персульфата. Немедленно полученный раствор заливали в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляли чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку на 10 лунок в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляли избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.

5. «Заморозка -оттаивание» клеточной биомассы

При комнатной температуре отбирали 1 г замороженной биомассы, переносили в 53 мл буфера С. Ресуспендировали биомассу на вортексе 5 минут, озвучивали на УЗ-бане 10 мин при 35°С. Далее ресуспендировали образец на вортексе 2 мин, и переносили в морозильную камеру на 70 минут при -70 °С. После озвучивали на УЗ-бане при 35°С 10 минут и осаждали образец 30 минут при 20000g.

6. Анализ образца в микроскопе

Образец после лизиса окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,1 мг/мл), после чего препарат помещали на предметное стекло и производили съемку на микроскопе при увеличение 100х.

7. Разрушение телец включения

Для разрушения телец включения отбирали осадки после лизиса клеточной биомассы (0,2 г) и разбавляли в 4 мл буфера С с 1.92 г мочевины. Озвучивали образец на УЗ-бане при 35° С 10 минут и осаждали при 15000g 20 минут. Отбирали супернатант (1 мл) и разбавляли Буфером С до 8 мл, оставили на 20 минут для ренатурация.

8. Экстракция образца в n-бутаноле (Метод А)

В 2 пробирки с 11 мл супернатанта добавили по 3,3 мл NaCl, 25,63 мл. (NH₄)₂SO₄ и 13,2 мл C₂H₅OH (для перевода GFP в этанольную фракцию), центрифугировали на 1500 g 10 мин (4200 rpm 15 минут). Отобрали этанольную фракцию добавили к ним ¼ объёма n-бутанола (2,3 мл). Интенсивно перемешали, затем центрифугировали 1500 g 10 мин (4200 rpm 15 минут).

Таблица 7. Контроль флуоресценции в процессе очистки методом А.

Фракция	Буфер+соль+ этанол	Водная фаза	Орг фаза	Осадок белый (между фаз)
Результат проверки	GFP да/нет	Нет	Нет	Нет
Фракция	Добавление н-бутанола	Водная фаза	Орг фаза	Осадок желтый (между фаз)
Результат проверки	GFP да/нет	Да	Да	Да
Фракция	Разбавление вода буфер*	Развед. вод фаза + осадок водой в 2 раза объединили*		Развед. вод фаза + осадок буфер в 2 раза*
		Объединили*
Результат проверки	Да	Да

*Фракции, полученные в процессе растворения целевого осадка после очистки