16) Особенности трансформации у дрожжей

Трансформация дрожжей

Первые работы по трансформации дрожжей были проведены в 1978 г. и ознаменовали эру генной инженерии дрожжей. Работа проводилась с использованием в качестве реципиентов протопластов дрожжей (leu-), а в качестве донорной ДНК не суммарной ДНК дрожжей, а рекомбинантной ДНК плазмиды ColE1. Было показано, что при трансформации происходит с частотой 10–7. В настоящее время используется серия векторов YIp, не­ сущих гены дрожжей и содержащих репликон бактериальной плазмиды.

Частота трансформации у дрожжей зависит от того, происходит ли внедрение фрагмента в хромосомную ДНК или он сохраняется в виде плазмиды.

Отличительной особенностью дрожжей является наличие постоянно активной системы гомологичной рекомбинации. Она позволяет дрожжам с большой вероятностью встраивать участок чужеродной двухцепочечной ДНК в свой геном. В природных условиях дрожжам, вероятно, система гомологичной рекомбинации нужна для восстановления поврежденных хромосом

17) Мобильные генетические элементы эу- и прокариот.

IS-элементы – это вставочные последовательности с молекулярной массой 1000-2000 пар нуклеотидов. В их структуре обнаружены два основных гена: ген транспозазы – фермента, обеспечивающего выщепление IS-элемента из одного сайта генома и перемещение в другой сайт, второй ген кодирует белок-регулятор, управляющий транскрипцией транспозазы и, следовательно, процессом транспозиции. По краям IS-элементы ограничены инвертированными повторами и прямыми повторами. В инвертированных повторах идентичные последовательности нуклеотидов в транс-положении (т.е. в разных цепях) повернуты на 180 градусов (как в палиндромах). Обычно в инвертированных краевых повторах насчитывается 15-40 пар нуклеотидов. Прямые повторы по краям транспозонов обычно содержат расположенные в одном направлении последовательности из 5-9 нуклеотидов.

Инвертированые повторы, очевидно, появились в транспозонах за счет встраивания МГЭ в сайты рестрикции, которые обычно представлены палиндромными последовательностями. А как же образуются прямые повторы? Согласно общепринятой гипотезе, ДНК-мишень, куда встраивается транспозон расщепляется с образованием «липких» концов, а транспозон присоединяется к выступающим (более длинным) концам ДНК-мишени. При этом со стороны коротких «липких» концов образуются бреши, которые затем застраиваются, приводя к появлению прямых повторов.

IS-элементы в основном изучены у бактерий. Они способны «перескакивать» в разные места генома бактерий, иногда с довольно высокой частотой (10^-3 - 10^-4 ). Такие перемещения могут осуществляться не только внутри самого генома, но и между геномом клетки и другими репликонами, имеющимися в бактериях (плазмиды, умеренные фаги), а также между симбиотическими репликонами.

IS-подобные транспозоны устроены как IS-элементы, но несут дополнительный «ген-пассажир», расположенный по направлению считывания вслед за генами транспозазы и белка-регулятора. В качестве гена-пассажира в транспозоне может присутствовать ген устойчивости к антибиотикам или же ген устойчивости к тяжелым металлам, а также любой другой ген из тех, которые встречаются в плазмидах и определяют их фенотипические свойства. Предполагают, что такие транспозоны сформировались путём захвата IS-элементами дополнительного гена-пассажира. Имеются даже примеры экспериментального превращения IS-элемента в транспозон за счет вставки бактериального гена.

Существует генетическая связь между плазмидами и транспозонами. К середине 70-х годов ХХ века микробиологами было установлено, что гены устойчивости к антибиотикам попадают в плазмиды за счет встраивания в них транспозонов, отсюда и схожесть наборов генов в плазмидах и транспозонах.

В настоящее время наиболее полно исследован транспозон Tn3. Он имеет длину около 5 тис. пар нуклеотидов, окружен по краям инвертированными (по 38 нуклеотидов) и прямыми повторами и несет 3 гена. Два из них кодируют ферменты необходимые для транспозиции – транспозазу (фермент переноса, начинает вырезание транспозона) и резолвазу (фермент, заканчивающий транспозицию и регулирующий активность транспозазы). В качестве третьего гена – гена-пассажира в транспозоне Tn3 выступает ген β-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину и некоторым его производным). Бактерии, имеющие в составе хромосомы такой транспозон защищены от пагубного действия антибиотиков пенициллинового ряда. Транспозон Tn3, будучи захваченным трансмиссивной плазмидой, может быть передан во многие клетки популяции микробов, что приводит к распространению антибиотикоустойчивости.

IS-модули – это сложные транспозоны, которые очевидно образовались путём захвата хромосомных генов двумя близлежащими IS-элементами. Причем, по краям таких транспозонов имеются или одинаковые копии IS-элементов, или же два различных IS-элемента. В случае наличия двух одинаковых IS-элементов по краям транспозона они могут иметь как прямую (у Tn9, рис. …), так и взаимно противоположную ориентацию нуклеотидных последовательностей (как у Tn5, рис. …). Каждый из краевых IS-элементов обладает своей собственной системой транспозиции и может выщепляться из ДНК самостоятельно или же в составе образованного модуля. Чем ближе в ДНК расположены IS-элементы, тем больше вероятность образования такого модуля, а также последующего выщепления из одного сайта и встраивания в другой сайт генома.