19) Транспозонный матугенез

На основе применения транспозонов создаются методы транспозонного мутагенеза. Чтобы осуществить транспозонный мутагенез необходимо иметь вектор для доставки транспозона.

В качестве векторов обычно используют фаги или плазмиды, которые можно легко элиминировать из бактерии-реципиента. Фаговые векторы обычно получают на основе умеренных фагов X, Mu и др. Для получения таких векторов фаги размножают на клетках штаммов, содержащих транспозоны в каком-либо репликоне.

В качестве плазмидных векторов для доставки транспозонов используют температурочувствительные мутантные плазмиды. Клетки, несущие в составе такой плазмиды транспозон, высевают на селективную среду и культивируют при повышенной температуре. При этом плазмида элиминируется и устойчивость к антибиотику появляется в результате внедрения транспозона в хромосому.

Большим достижением транспозонного мутагенеза является введение с использованием плазмид широкого круга хозяев транспозонов, ранее обнаруженных у энтеробактерий и псевдомонад, в клетки других бактерий.

Транспозоны с использованием трансдуцирующих фагов применяются для осуществления локализованного мутагенеза in vivo. Фаголизат получают из клеток штамма, несущего транспозон, встроенный рядом с интересующим геном. Затем обрабатывают его мутагеном и используют для трансдукции какого-либо реципиентного штамма. Отбор трансдуктантов проводят на среде с соответствующим антибиотиком по приобретению устойчивости. Важнейшей характеристикой полученных мутантов является их устойчивость. Некоторые мутанты способны ревертировать, причем с высокой частотой, что нужно учитывать при конструировании штамма-продуцента.

20) Векторы, используемые для введения транспозонов

В качестве векторов обычно используют фаги или плазмиды, которые можно легко элиминировать из бактерии-реципиента. Фаговые векторы обычно получают на основе умеренных фагов X, Mu и др. Для получения таких векторов фаги размножают на клетках штаммов, содержащих транспозоны в каком-либо репликоне.

В качестве плазмидных векторов для доставки транспозонов используют температурочувствительные мутантные плазмиды. Клетки, несущие в составе такой плазмиды транспозон, высевают на селективную среду и культивируют при повышенной температуре. При этом плазмида элиминируется и устойчивость к антибиотику появляется в результате внедрения транспозона в хромосому.

21) Методы получения рекомбинантной днк

Сущность процесса заключается во встраивании фрагментов ДНК, содержащих интересующий участок, в векторные молекулы ДНК (плазмидные или вирусные), которые могут быть перенесены в клетки и там автономно реплицироваться. Далее проводится отбор клеток, содержащих рекомбинантные ДНК, и индивидуальных клонов с нужным сегментом ДНК.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторы:

1. Наращивание 3'-концов фрагментов ДНК и векторной ДНК комплементарными гомополинуклеотидными последовательностями для создания "липких" концов.

2. Создание "липких" концов с помощью расщепления молекул ДНК рестриктазами, которые характеризуются высокой специфичностью.

3. Комбинация первых двух способов, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями ("линкерами").

После встраивания чужеродной ДНК в вектор, ее ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Возникшие бреши могут быть застроены in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки