28) Плазмидные векторы, используемые для клонирования в клетка прокариот.

Плазмиды - внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, способные к автономной репликации. Самые распространенные плазмидные векторы клеток E. coli - плазмида pBR322 и ее производные, длиной 4361 п.н., с репликатором от плазмиды pMB1 и свойством мультикопийности.

pBR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, что предоставляет возможности для клонирования генов. Несовместимость плазмид обусловлена подавлением репликации или блокированием распределения дочерних молекул ДНК. Плазмиды со строгим контролем репликации могут интегрироваться в бактериальную хромосому и подчиняться ее репликационному аппарату, став эписомами. Контроль копийности осуществляется базовым репликоном плазмиды, включающим ori, cop, inc сайты и гены их функционирования.Фенотипические признаки. Плазмиды передают клеткам различные признаки: устойчивость к антибиотикам (более 20), тяжелым металлам: висмуту, кадмию, кобальту, ртути, свинцу; соединениям мышьяка, УФ-свету и т.д. Плазмиды играют важную роль в природе, передавая клеткам различные полезные признаки, такие как устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, УФ-излучению и другим неблагоприятным факторам. Они служат посредниками, способствуя межклеточному обмену генами, что позволяет клеткам быстро адаптироваться к изменяющимся условиям.

В последнее время частота естественного переноса плазмид возросла из-за чрезмерного использования антибактериальных веществ в медицине и загрязнения окружающей среды. В результате появились устойчивые к лекарствам штаммы бактерий, а также микроорганизмы, эффективно утилизирующие токсичные вещества. Плазмиды также могут вызывать изменения в белках внешней мембраны клеток, повышая их устойчивость к иммунной системе.

Ярким примером является F-плазмида клеток E. coli K12. Попадая в клетку, она может существовать автономно или встраиваться в бактериальную хромосому, изменяя свойства клетки и наделяя ее способностью передавать свои гены другим клеткам с высокой частотой. Таким образом, плазмиды демонстрируют механизм "естественной генной инженерии", происходящей в природе.

29) Векторы для клонирования крупных фрагментов днk

Клонирование больших (50—100 т.п.н. и более) фрагментов ДНК — важная проблема, поскольку при этом, во-первых, суще­ственно облегчается создание геномных библиотек, а, во-вторых, удается провести функциональный анализ полных больших генов или их комплексов. Действительно, многие гены эукариот состоят из нескольких сотен т.п.н., а своеобразным рекордсменом является ген дистрофина, чья транскрибируемая область превышает 2 млн.п.н. Поэтому в последнее десятилетие были предприняты усилия по конструированию емких векторов. Сначала проблема была ре­шена для дрожжевых клеток созданием искусственных хромосом YAC. Затем такие векторы были созданы на базе ДНК плазмидных профагов Р1 (РАС — PI artificial chromosome) и N15 (NAC — N15 artificial chromosome), а также F-плазмиды (ВАС — bacterial artificial chromosome). Векторы рРАС и pNAC позволяют клонировать сверхкрупные, а рВАС — гигантские фрагменты ДНК. Уточним, что названия YAC, РАС, ВАС и т. д. применя­ют для рекДНК, а сами векторы обозначают pYAC, рРАС и рВАС.

Векторы pNAC — пока единственные линейные прокариотические векторы. При клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК в этом случае выше. В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. Отметим важную особенность репликонов, использованных для создания вышеупомянутых векторов: все они малокопийны. Это вызвано необходимостью обеспечить стабильность клонируе­мой ДНК. Известно, что с увеличением ее размера увеличивается вероятность ее структурных перестроек (делеции, вставки, инвер­сии). Вероятность повышается по мере увеличения числа копий рекДНК, поскольку все более сказывается эффект межмолекуляр­ной рекомбинации.