6) Подготовка исходного штамма к селекции

1. Исходный штамм рассевают на чашки Петри и отбирают несколько сотен клонов, имеющих типичную для данной культуры морфологию и варианты с некоторыми морфологическими отклонениями.

2. Производят несколько пассажей для подтверждения того, что эти варианты сохраняют свои морфологические особенности.

3. Оценивают уровень продукции интересующего метаболита у вариантов с типичной для данной культуры морфологией и с некоторыми морфологическими отклонениями.

4. Несколько клонов с наиболее высоким уровнем продукции по отношению к уровню контроля (которым служит исходная не рассевавшаяся культура) отбирают и проверяют на продукцию в нескольких повторах, а затем отбирают один клон, имеющий устойчиво высокий уровень продукции. Такая длительная процедура называется «чисткой исходной культуры»

5. Отобранный клон снова рассевают и оценивают его уровень продукции путем анализа не менее 100 типичных клонов. Значения уровней продукции таких субклонов выражают в процентах по отношению к продукции исходного (родительского) и располагают в вариационном ряду 1, вычисляя для них статистические показатели: • среднее арифметическое (Х); • квадратическое отклонение (σ); • коэффициент изменчивости (сv = σ × 100).

6. Субклоны, попавшие в крайнюю правую часть этого ряда (максимальная продукция), отбирают и опять оценивают по уровню продукции. При этом отбирается только один из них.

7. Этот субклон опять рассеивают и, проверив, не менее 100 высеянных клонов, строят вариационный ряд 2, вычисляя его показатели. Сравнивают показатели коэффициента изменчивости двух вариационных рядов. Если эти значения существенно не отличаются, то подготовку исходного для селекции штамма заканчивают, отбирая субклоны из 1-го вариационного ряда, а 2-й ряд (собственный ряд этого субклона) считают контрольным. Если при сравнении коэффициентов изменчивости у 2-го ряда наблюдается его уменьшение, то целесообразно провести еще один этап клонирования, выбрав из правой части 2-го ряда «лучший клон». Построить на его основе 3- й вариационный ряд и определить его коэффициент. Если значения коэффициентов изменчивости 2-го и 3-го рядов не отличаются, то клонирование прекращают, а если опять наблюдаются отличия, то продолжают процедуру

7) Мутагенез in vivo. Типы мутагенов, используемых при индуцированном мутагенезе.

Долгое время создание микробных продуцентов биологически активных веществ основывалось на применение методов мутагенеза in vivo.

Однако мутагенез in vivo имеет и ряд недостатков:

• воздействию мутагена подвергается весь геном;

• возникает ряд множественных мутаций, что затрудняет их идентификацию.

Появление методологии генной инженерии позволяет внедрить в селекцию промышленных штаммов методы мутагенеза in vitro, с помощью которых можно вносить специфические изменения в нуклеотидные последовательности отдельных генов.

В наиболее простом варианте ген, в последовательность которого необходимо внести изменения, клонируют в составе вектора по удобным сайтам рестрикции. Затем его выделяют и подвергают обработке мутагеном

in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что значительно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина. Была выделена гибридная плазмида, содержащая в своем составе весь треониновый оперон, а для сверхсинтеза гомосерина необходима работатолько двух первых генов оперона, поэтому последующее превращение гомосерина в треонин должно быть блокировано. Эта цель достигалась

обработкой in vitro гибридной плазмиды гидроксиламином. Затем такой

плазмидой трансформировали Thr B штамм и отобрали мутанты,продуцирующие гомосерин в большом количестве.

Мутагены - факторы, вызывающие наследственные изменения(мутации)

Мутагены бывают:

• Физические (ионизирующую радиацию и ультрафиолетовое излучение)

• Химические(являются органические и неорганические кислоты, щелочи, перекиси, соли металлов,фенолы)

• Биологические(вирусы, которые вызывают хромосомные аберрации в культивируемых клетках, например, вирус гриппа)