32. Векторы на основе днк нитевидных фагов

Нитевидные вирусы М13, fd, f1, бактерии E. coli (кишечной палочки), называемые обычно бактериофагами или просто фагами, наиболее подходят для создания одноцепочечных векторных молекул ДНК.

Частицы этих фагов представляют собой трубочку (1000 х 6 нм) из гидрофобного фагового белка pVIII, внутри которой содержится молекула кольцевой одноцепочечной ДНК. На одном из концов фаговой частицы молекула ДНК взаимодействует с несколькими молекулами фагового белка pIII, называемого белком-лоцманом.

Последовательность нуклеотидов фаговой ДНК расшифрована (6407 нуклеотидов для фага M13, 6408 для фага fd).

Нитевидные фаги адсорбируются на половых ворсинках клеток E. coli (белковых трубочках, предназначенных для переноса ДНК из клетки в клетку; рис. 1, а), и одноцепочечная кольцевая ДНК фага в комплексе с белком- лоцманом проникает в цитоплазму клетки (рис. 1, б), где происходит достройка второй цепи фаговой ДНК.

Образовавшаяся двухцепочечная кольцевая молекула ДНК (рис. 1, в), называемая репликативной формой (РФ), реплицируется, достигая 200–300 копий на клет- ку. Затем репликация этих молекул ДНК в основном осуществляется асимметрично и синтезируется большое количество одной из двух цепей (обозначается как (+)-цепь), которая покрывается димерами фагового белка pV (рис. 1, г) и взаимодействует с белком-лоцма- ном pIII (рис. 1, д). При выходе фаговой ДНК из клетки через плазматическую мембрану белок pV постепенно замещается на белок оболочки pVIII, находящийся на клеточной мембране (рис. 1, е). Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно секретируются из клеток без лизиса (разрушения) последних. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Скорость роста клеток E. coli, зараженных нитевидным фагом, на 25–50% ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании на твердой агаризованной среде нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки.

При размножении данных фагов их геном в бактериальной клетке одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. На одноцепочечной вирионной ДНК обычные генно-инженерные эксперименты невыполнимы. Однако их с успехом можно осуществить на репликативной форме генома нитевидных фагов. Все это обусловило использование данных фагов для создания клонирующих векторов.

33. Создание геномной библиотеки

Геномные библиотеки обычно создают с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага λ или космиды. Эти векторы содержат большие вставки, благодаря чему минимизируется число рекомбинантов, наобходимых для составления библиотеки

На самом деле для создания библиотеки, вероятность обнаружения в которой определенного сегмента генома превышает 99%, нужно получить ~ 106 отдельных рекомбинантных молекул, поскольку лигирование отдельных фрагментов происходит случайно.

Полная космидная библиотека содержит меньше рекомбинантных молекул, поскольку размер вставок может достигать 45 т.п.н. Фрагменты суммарной геномной ДНК для конструирования библиотек можно получать несколькими способами. Наиболее удобный из них состоит в частичном расщеплении ДНК рестриктирующей эндонуклеазой, сайт узнавания которой содержит шесть оснований (или более), а образующиеся липкие концы соответствуют липким концам выбранного вектора. В этом случае разрезание осуществляют лишь в ограниченном числе возможных сайтов. Поскольку выбор таких сайтов производится случайно и в используемом препарате геномной ДНК содержится много копий любого геномного сегмента, практически каждый сегмент ДНК должен быть представлен во фрагментах ДНК, пригодных по своему размеру для клонирования. П

ри таком подходе, однако, может получиться неполная библиотека. Те-части генома, в которых сайты узнавания рестриктирующих эндонуклеаз находятся слишком далеко друг от друга, не смогут включиться в жизнеспособный рекомбинантный фаг. С другой стороны, те области генома, в которых сайты узнавания тесно сгруппированы, будут разделены на очень короткие фрагменты, и не все из них будут представлены в библиотеке.