24)Метод слияния протопластов и его использование для получения рекомбинантов у бактерий, грибов и дрожжей

Получив протопласты, можно приступать к их слиянию или трансформировать их чужеродной ДНК. Метод слияния протопластов стал одним из важных методов получения генетических рекомбинантов.

Преимущества этого метода по сравнению с другими способами обмена генетической информацией очевидны:

• преодоление барьера нескрещиваемости при переводе клеток в протопласты;

• слияние не только геномов, но и родительских цитоплазм;

• отсутствие направленности генетического переноса – оба родителя являются донорами;

• в одной клетке можно объединить не только два генома, но три и более;

• слияние протопластов осуществляют не только для представителей разных видов, но и родов. Есть данные о слиянии протопластов разных царств (эритроцитов млекопитающих и дрожжевых протопластов).

Слияние протопластов осуществляется с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоль), который снижает поверхностный заряд протопластов и связывает окружающую их воду, создавая условия для тесного контакта и слипания мембран протопластов. В местах слипания происходит разрыв мембран, и содержимое объединяется под одной мембраной. Появившиеся гибриды сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки.

Процесс слияния протопластов регулируется ионами Ca2+ и Mn2+, а также температурой. Для выявления рекомбинантного потомства необходимо обеспечить селективные условия, позволяющие предотвратить реверсии рекомбинантов к исходным родительским формам. Частота слияния основана на учете частоты комплементации, хотя эти два события не всегда коррелируют.

У бактерий продукты слияния протопластов могут представлять собой как гаплоидные рекомбинанты, так и диплоидные формы, тогда как у мицелиальных грибов образуются комплементирующие гетерокарионы, а у дрожжей - диплоиды.

25) Характеристика ферментов, используемых в генной инженерии

В генетической инженерии используется большая группа ферментов. Успехи генетической инженерии стали возможны, прежде всего, благодаря изучению ферментов, позволяющих проводить химические операции с генетическим материалом. В генетической инженерии ферменты служат инструментами молекулярного манипулирования с генетическим материалом, где они выступают в роли «скальпеля», «ножниц» и «ниток для сшивания». Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

— ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

— ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

— ферменты соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

— ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

Рестриктазы — специфические эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенных точках — сайтах рестрикции. Впервые были выделены из E. coli в 1968 г.

Основной характеристикой рестриктаз является их субстратная специфичность. Сейчас известны следующие основные проявления специфичности этих ферментов: узнаваемая последовательность, место расщепления, зависимость действия рестриктаз от метилирования оснований в пределах узнаваемой последовательности.

Узнаваемая последовательность нуклеотидов в молекулярной биологии называется сайт рестрикции и является наиболее важным параметром рестриктаз. Сайт рестрикции характеризуется последовательностью нуклеотидов, их числом, а также типом строения. Для большинства участков, узнаваемых рестриктазами, характерная вращательная симметрия второго порядка, т.е они являются полиндромами. Несмотря на то, что все рестриктазы узнают на ДНК строго определенные последовательности, различают 3 основных класса рестриктаз. [3]

ДНК – полимеразы обладают способностью удлиннять цепь ДНК в направлении 5’→3’ путем присоединения комплементарного нуклеотида. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 г. из E. Coli (Pol I). Фермент состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 109 кДА и имеет трехдоменную структуру. Каждый домен обладает своей 5’—3’ полимеразной, 3’—5’ – экзонуклеазной или 5’—3’ экзонуклеазной активностью. [3]

В молекулярной биотехнологии наиболее часто используется фермент ДНК-полимераза I, выделенная из E. coli, а также термостабильная ДНК-полимераза — Taq-полимераза сыграла особую важную роль в разработке технологий полимеразной цепной реакции. [1]

Обратная транскриптаза или ревертаза. РНК зависимая ДНК-полимераза, с помощью которого осуществляется обратная транскрипция, т.е. синтез ДНК на РНК матрице. Ревертаза кодируется геномами некоторых РНК-содержащих вирусов и подвижных генетических элементов генома высших организмов, в генной инженерии с их помощью можно получить ген. Она используется для транскрипции мРНК в комплементарную цепь ДНК.

Обратная транскриптаза состоит из двух субъедениц с М. м. 65 и 95 кДа и обладает тремя ферментативными активностями: 1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; 2) РНК-азной, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК — ДНК; 3) ДНК-эндонуклеазной, расщепляющей молекулы ДНК по внутренним сложноэфирным связям между нуклеотидами. [3]

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеазная, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. [3]

Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий участок нуклеиновых кислот (праймер). Праймером может служить одноцепочечный фрагмент как РНК, так и ДНК. Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНК-азной активности. При этом удается получать полимеразные ДНК-копии целевых молекул РНК. [2]

ДНК – лигазы. В 1957 г. молекулярные биологи Метью Мезелсон и Франклин Сталь, исследуя механизмы репликации, ДНК установили, что репликация ДНК имеет полуконсервативный механизм. Это означает, что каждая дочерняя спираль ДНК состоит из одной старой и из одной новой вновь синтезированной цепи. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК и в 1967 г. такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, «на рисунке 4».

Создание фосфодиэфирных связей в одноцепочечных разрывах двухцепочечной ДНК с помощью ДНК-лигаз является наряду с реструкцией одним из важнейших этапов получения рекомбинантных ДНК in vitro. ДНК-лигазы разделяют на два семейства в зависимости от механизма действия:

1. АТФ – зависимые лигазы;

2. NAD+ — зависимые ДНК-лигазы.

Наибольшее применение в генной инженерии находит АТФ-зависимая ДНК-лигаза бактериофага Т-4. Т-4-ДНК-лигаза осуществляет соединение фрагментов ДНК, обладающих комплементарными «липкими» или «тупыми» концами. Реакция идёт в два этапа. На первом этапе образуется комплек фермент — АМФ, а на втором остаток АМФ переносится на 5’-фосфатную группу концевого нуклеотида в точке разрыва ДНК.

Нуклеазы — ферменты, гидролизующие молекулы нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нулкеотиды. Различают ДНК-азы и РНК-азы, гидролизующие соответственно ДНК и РНК. Различают экзонуклеазы — гидролизирующие 5’ или 3’- концевые фосфатные связи и эндонуклеазы — расщепляющие внутренние связи полинуклеотидной цепи молекулы ДНК. [3]

Некоторые нуклеазы гидролизуют избирательно только одноцепочечные молекулы, только двухцепочечные молекулы ДНК или гибридные ДНК-РНК молекулы. [3]

В молекулярной биотехнологии наиболее широко применяются экзонуклеаза III E. coli, нуклеаза S1, панкреатическая рибонуклеаза А, панкреатическая дезоксирибонуклеаза I и др. [2]