2 курс / Биохимия / Н.Ю.Коневалова - Биохимия

единение, интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор холестерина.

3. Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора холестерина, инкубируют в течение 10 минут при 37 0С и колориметрируют при 500 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация холестерина рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация холестерина в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация холестерина в стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальный уровень общего холестерина - 140200 мг/дл или 3,65-5,2 ммоль/л,

При рождении концентрация общего холестерина менее 2,6 ммоль/л, затем она постепенно растет, однако в детстве, как правило, не превышает 4,1 ммоль/л.

Диагностическое значение: Повышенная концентрация холестерина крови (гиперхолестеринемия) – это один из главных факторов риска развития атеросклероза. При оценке зависимости смертности от ИБС и концентрации холестерина установлено, что смертность удваивается при увеличении концентрации холестерина с 5,2 до 6,5 ммоль/л, и увеличивается в 4 раза при концентрации холестерина 7,8 ммоль/л.

Европейское общество по борьбе с атеросклерозом разделяет уровень холестерина по степеням тяжести:

легкая гиперхолестеринемия – 200-250 мг/дл (5,2-6,5 ммоль/л), умеренная гиперхолестеринемия – 250-300 мг/дл (6,5-7,8 ммоль/л), высокая гиперхолестеринемия – свыше 300 мг/дл (7,8 ммоль/л). Это имеет значение для оценки степени риска развития атероскле-

роза и ИБС и, соответственно, определения тактики ведения пациентов. Однако изолированное определение уровня общего холестерина в настоящее время не рекомендуется проводить, даже для скрининга. Как известно, общий холестерин представляет собой суммарную концен-

641

трацию холестерина основных классов липопротеинов: ХС-ЛПВП, ХСЛПОНП и ХС-ЛПНП. На практике проводится определение общего холестерина, холестерина ЛПВП и триацилглицеринов, на основании полученных результатов рассчитывают ХС-ЛПОНП и ХС-ЛПНП (порядок расчета изложен в работе "Расчет индекса атерогенности липидов"). Исходя из полученных результатов, определяют тип гиперлипопротеинемии.

Гиперхолестеринемия может быть первичной или семейной, обусловленной генетической предрасположенностью (например: из-за отсутствия или недостатка рецепторов к ЛПНП) или преобладанием в рационе продуктов, богатых холестерином (животные жиры, яйца, твердые сыры и др.).

Но значительно чаще встречается вторичная гиперхолестеринемия, т.е. обусловленная различными заболеваниями. Наиболее часто гиперхолестеринемия наблюдается при: гипотиреозе, холестазе, ожирении, заболеваниях почек, сахарном диабете, приеме некоторых лекарственных препаратов (пероральные контрацептивы, гипотензивные препараты и др.),

Гипохолестеринемия – т.е. снижение концентрации менее 3,65 ммоль/л (у взрослых) имеет значительно меньшее клиникодиагностическое значение, наблюдается при: голодании, злокачественных новообразованиях, гипертиреозе, тяжелых заболеваниях печени и т.д.

5. МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода состоит в том, что триацилглицерины гидролизуются липопротеинлипазой до глицерина и жирных кислот, глицерин через ряд реакций взаимодействует с глицеролкиназой, а затем с глицеринфосфатоксидазой с высвобождением перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы превращает 4-хлорфенол и 4-аминофеназон в производное хиноноимидина, имеющего красную окраску, интенсивность которой пропорциональна концентрации триацилглицеринов.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор глицерина.

3. Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора глицерина, инкубируют в течение 10 минут при 37 0С и колориметрируют при 500 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

642

Концентрация триацилглицеринов рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация триацилглицеринов в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация триацилглицеринов в стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальный уровень триацилглицеринов в крови – 0,50 - 1,80 ммоль/л;

Диагностическое значение: В настоящее время установлено, что повышение концентрации триацилглицеринов (гипертриацилглицеринемия) является самостоятельным фактором риска развития атеросклероза и ИБС.

Европейское общество по борьбе с атеросклерозом и Международный комитет по оценке гипертриацилглицеринемии как сосудистого фактора риска (1996) разделяют уровень триацилглицеринов по степеням тяжести:

легкая гипертриацилглицеринемия - 1,81-2,25 ммоль/л; умеренная гипертриацилглицеринемия - 2,26-4,50 ммоль/л; высокая гипертриацилглицеринемия - > 4,50 ммоль/л.

Гипертриацилглицеринемия может быть первичной или семейной, обусловленной генетической предрасположенностью (например: из-за отсутствия или недостатка липопротеинлипазы) или преобладанием в рационе некоторых продуктов (простые углеводы, алкоголь, животные жиры и др.).

Но значительно чаще встречается вторичная гипертриацилглицеринемия, т.е. обусловленная различными заболеваниями. Наиболее часто гипертриацилглицеринемия наблюдается при: сахарном диабете, ожирении, заболеваниях почек (нефротический синдром и хроническая почечная недостаточность), приеме некоторых лекарственных препара-

тов (пероральные контрацептивы, мочегонные, β-блокаторы и др.), Гипотриацилглицеринемия, т.е. снижение концентрации менее

0,5 ммоль/л (у взрослых), имеет значительно меньшее клиникодиагностическое значение и наблюдается при: голодании, злокачественных новообразованиях, тяжелых заболеваниях печени и т.д.

643

6. РАСЧЕТ ИНДЕКСА АТЕРОГЕННОСТИ ЛИПИДОВ (ИА) НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО

ХОЛЕСТЕРИНА, ХС-ЛПВП И ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ

Индекс атерогенности (ИА) – это отношение холестерина атерогенных классов липопротеинов к холестерину антиатерогенных классов липопротеинов:

ИА= (ОХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП (абсолютных единиц).

Диагностическое значение: Установлено, что атерогенные гиперлипидемии являются одним из основных факторов риска развития атеросклероза. К настоящему времени во всем мире пришли к заключению, что для практической деятельности достаточно определения концентрации общего холестерина (ОХС), холестерина ЛПВП (ХС-ЛПВП), триацилглицеринов (ТГ), определение липопротеина (а). Кроме того, рассчитывается индекс атерогенности (ИА) и уровень холестерина ЛПНП (ХС-ЛПНП).

Индекс атерогенности используется для оценки степени риска развития атеросклероза, ИБС.

Норма – до 3

низкий риск – 3-4 средний риск – 4-5 высокий риск – более 5.

Для определения тактики ведения пациента необходимо рассчитать ХС-ЛПНП:

ХС-ЛПНП = ХСобщ – ХС-ЛПВП – ХС-ЛПОНП ХС-ЛПОНП = ТГ *0,458

По классификации Европейского общества по борьбе с атеросклерозом уровень ХС-ЛПНП разделяется по степеням тяжести:

нормальный уровень ХС-ЛПНП - 1,91-2,60 ммоль/л; легкое увеличение уровня ХС-ЛПНП - 2,61-3,40 ммоль/л;

умеренное увеличение уровня ХС-ЛПНП - 3,41-5,05 ммоль/л; выраженное увеличение уровня ХС-ЛПНП - > 5,05 ммоль/л.

Диагностическое значение определения уровня ХС-ЛПНП:

1.По уровню увеличения ХС-ЛПНП проводится общая стратификация ведения пациентов: т.е. определяют, подходят ли пациенту диетические мероприятия или нужна сразу медикаментозная терапия.

2.Уровень увеличения ХС-ЛПНП оказывает влияние на жесткость и длительность диетических мероприятий

3.При проведении гиполипидемической терапии целевыми уровнями являются ХС-ЛПНП и общий холестерин.

644

−потребление большого количества белка,

−усиление катаболизма белка.

2.Усиление реабсорбции:

−при значительном обезвоживании.

Следует отметить такие заболевания, как болезнь Аддисона, тяжелые инфекционные заболевания, сопровождающиеся интенсивным распадом белков, ожоги, перитониты.

Уменьшение содержания мочевины в крови наблюдается при нарушении мочевинообразовательной функции печени в результате паренхиматозной желтухи, острой дистрофии органа, декомпенсированного цирроза.

8. БЕНЗИДИНОВАЯ ПРОБА НА КРОВЬ

Принцип реакции: Гемоглобин расщепляет перекись водорода с высвобождением атомарного кислорода, который окисляет бензидин. Образующиеся продукты окисления бензидина имеют синюю или зеленую окраску.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Дефибринированная кровь, разведенная водой.

2.Раствор бензидина, 50 г/л (в ледяной уксусной кислоте, свежеприготовленный).

3.Раствор перекиси водорода, 30 г/л.

Ход работы:В одну пробирку налить 5 капель разведенной дефибринированной крови и 5 капель бензидина, затем добавить 5 капель раствора перекиси водорода. В другую пробирку прилить 5 капель дистиллированной воды, 5 капель бензидина и 5 капель перекиси водорода.

Сравнить полученные результаты.

Диагностическое значение: Реакция очень чувствительна и используется для обнаружения даже небольших количеств крови. В клинической практике эта реакция положена в основу обнаружения скрытой крови в кале, а также для контроля предстерилизационной очистки инструментария и посуды.

9. КАЧЕСТВЕННАЯРЕАКЦИЯНАСАХАРВ МОЧЕ

Принцип реакции: Для качественного обнаружения сахара в моче используют реактив Ниландера, содержащий азотнокислый висмут. В щелочной среде образуется гидрат окиси висмута, который восстанаваливается глюкозой до металлического висмута, окрашивающего жидкость в черно-бурый цвет.

646

Реакция Ниландера специфично используется для обнаружения сахара в моче, т.к. азотнокислый висмут не восстанавливается мочевой кислотой (нормальный компонент мочи) в отличие от гидрата окиси меди (реакция Троммера и с жидкостью Фелинга).

Реактивы, исследуемый материал:

1.Моча, содержащая глюкозу, и нормальная моча

2.Реактив Ниландера.

Ход работы: К 20 каплям исследуемой мочи прилить 20 капель реактива Ниландера и кипятить 1-2 минуты.

Диагностическое значение: Моча здорового человека содержит минимальное количество глюкозы, которое обычными методами не определяется, поэтому принято считать, что в норме глюкозы в моче нет. Обнаружение глюкозы в моче называется глюкозурия. При пр е- вышении почечного порога (это 7,8-9,99 ммоль/л глюкозы в крови) глюкоза появляется в моче.

Почечный порог выделения – это концентрация вещества в крови, превышение которой ведет к прекращению его реабсорбции в почечных канальцах.

Почечный порог глюкозы может увеличиваться – при атеросклеротическом поражении сосудов почек, а также уменьшаться – при так называемом почечном диабете (эссенциальная почечная глюкозурия – аутосомно-рецессивное заболевание), когда глюкозурия появляется при нормальной концентрации глюкозы в крови.

Глюкозурия может быть:

−физиологическая – при стрессах, повышенном приеме углеводов пожилыми людьми,

−экстраренальная – т.е. не связанная с заболеваниями почек. Она встречается при сахарном диабете, панкреатитах, феохромоцитомах, гипертиреозе, инсультах, отравлениях окисью углерода, морфием, хлороформом и т.д.,

−ренальная – почечный диабет, хронические нефриты, острая почечная недостаточность, гестозы беременных, отравления фосфором.

10.КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ФЕНИЛПИРОВИНОГРАДНУЮ КИСЛОТУ (ПРОБА ФЕЛИНГА)

Принцип пробы Фелинга: Фенилпировиноградная кислота с ионами трехвалентного железа образует комплексное соединение синезеленого цвета.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Раствор хлорного железа, 100 г/л. 2. Моча. 3. Фильтровальная бумага.

647

Ход работыНа фильтровальную бумагу нанести несколько капель мочи, добавить 8-10 капель раствора хлорного железа. Оценить результат.

Диагностическое значение: В норме основным путем превращения фенилаланина в тканях (в основном в печени) является его окисление фенилаланингидроксилазой в тирозин. Вследствие дефекта гена, ответственного за выработку в печени этого фермента, не происходит его синтеза. Фенилаланин начинает превращаться по компенсаторному пути

– вступает в переаминирование с образованием фенилпировиноградной кислоты. Фенилпируват накапливается в крови, тканях, выводится с мочой; развивается фенилкетонурия. Вследствие накопления фенилпирувата нарушается синтез миелина и миелинизация нервных волокон, а вследствие недостатка тирозина отмечается дефицит Т3, Т4, дофамина и катехоламинов, в результате дети отстают в умственном развитии, развивается фенилпировиноградная олигофрения. Своевременное выявление этой ферментопатии позволяет изменить характер питания (ограничение поступления фенилаланина, в том числе и с молоком матери) и предупредить развитие олигофрении.

Проба Фелинга до недавнего времени была обязательным элементом скрининга. Однако, для того, чтобы фенилпируват в моче присутствовал в обнаруживаемых этим методом количествах, необходимо длительное время (не ранее 2-х месячного возраста ребенка), к этому времени уже развивается уже стадия выраженного заболевания, а терапевтические мероприятия необходимо проводить с первых жизни. К 2 месяцам жизни у ребенка с фенилкетонурией уже имеется развернутая клиническая картина заболевания. Особенно это заметно у смуглокожих и темноволосых детей: наступает гипопигментация кожи, начинают заметно светлеть волосы и глаза. К 4-х месячному возрасту уже видны проявления энцефалопатии: у ребенка исчезает "комплекс оживления", возникающий в норме на обращение к нему взрослого.

В настоящее время для ранней диагностики фенилкетонурии проводят пробу Гатри. Она заключается в том, что диск с кровью, новорожденного, помещают на питательную среду с бактериями, нуждающимися для роста в фенилаланине. При наличии этой аминокислоты в крови при фенилкетонурии идет рост этих микроорганизмов.

11.КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КЕТОНОВЫЕ ТЕЛАВ МОЧЕ

Принцип реакции: Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание (проба Легаля). После подкисления концентрированной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.

Реактивы, исследуемый материал:

648

1.Моча.

2.Раствор нитропруссида натрия, 100 г/л.

3.Концентрированная уксусная кислота.

4.Раствор едкого натра, 100 г/л.

Ход работы: В пробирку налить 1 каплю мочи, 1 каплю раствора едкого натра и 1 каплю свежеприготовленного нитропруссида натрия. Наблюдать появление оранжево-красного окрашивания. Добавить 3 капли концентрированной уксусной кислоты.

Оценить результат.

Диагностическое значение: Нормальная моча содержит незначительные количества кетоновых тел (20-50 мг в сутки), которые не о б- наруживаются обычными качественными пробами. Наличие кетоновых тел в моче называется кетонурия. Кетоновые тела – это продукты не-

полного окисления липидов и белков: β-гидрооксимасляная кислота, ацетоуксусная кислота и ацетон. Кетоновые тела синтезируются в печени. Их определение имеет наибольшее значение для диагностики метаболической декомпенсации сахарного диабета. Обычно кетонурия появляется при уровне глюкозы в крови 13,5-16,7 ммоль/л и/или при глюкозурии более 3 %. Кетонурия может определяться при:

−некомпенсированном диабете,

−гиперкетонемической коме,

−несбалансированном питании (голодание, диета, направленная на похудание, употребление преимущественно белковой пищи, исключение из рациона углеводов),

−гиперпродукция кортикостероидов (опухоли гипофиза или надпочечников),

−дизентерия, токсикозы в детском возрасте, приводящие к кетоацидозу.

12.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЛЮКОЗЫ,КЕТОНОВЫХ ТЕЛ, БЕЛКА

ИПРИМЕСЕЙ КРОВИ В МОЧЕ МЕТОДОМ "СУХОЙ" ХИМИИ ПРИ ПОМОЩИ ТЕСТ-ПОЛОСОК ФИРМЫBOEHRINGER МАNNНЕIМ

Принцип метода: Тест-полоска представляет собой полифункциональную диагностическую тест-систему, с помощью которой проводится не только качественное, но и полуколичественное определение показателей, позволяющих оценить физико-химические свойства мочи. На полоске имеется несколько зон индикации (количество зависит от марки тест-полоски, фирма BOEHRINGER МАNNНЕIМ производит около 50 наименований). Зоны пропитаны различными веществами, которые взаимодействуют с метаболитами мочи, при этом развивается цветное окрашивание зоны индикации, интенсивность которого пропорциональна концен-

649

трации исследуемых веществ. На упаковке имеется шкала индикации, с котрой сравнивают исследуемую тест-полоску.

Ход работы: В пробирку налить примерно около 10-15 мл мочи. Окунуть в нее на несколько минут тест-полоску. После развития окраски сравнить со шкалой нанесенной на коробке тест-полосок.

Диагностическое значение: Глюкоза - при патологии имеет ме-

сто глюкозурия, которая обусловлена:

–повышением содержания глюкозы в крови выше пороговых величин (7,8-9,9 ммоль/л); может наблюдаться при сахарном диабете, стероидном диабете и ряде других процессов;

–при дефекте белка-переносчика, участвующего в реабсорбции глюкозы в проксимальных канальцах (почечный диабет).

Кетоновые тела - выделение определяемых количеств называется кетонурией. При сахарном диабете ежесуточно может выделяться до 150 г кетоновых тел. С мочой всегда выделяются вместе ацетон и ацето-

уксусная кислота; β-гидроксимасляная кислота появляется в моче лишь при сильном увеличении экскреции кетоновых тел. Кетонурия бывает при диабете, голодании, тиреотоксикозе (усиленный распад углеводов), при инфекционных заболеваниях.

Белок - повышение белка в моче - протеинурия. Источники белка мочи — белки плазмы крови и белки почечной ткани (при патологии). Протеинурии делятся на почечные и внепочечные. При почечных протеинуриях белки плазмы крови попадают в мочу из-за органического повреждения нефрона, увеличения размеров пор почечного фильтра и замедления тока крови в клубочках. Внепочечные протеинурии связаны с поражением мочевых путей или предстательной железы. В моче возможно определение белков-ферментов, например, при панкреатитах находят повышение активности α-амилазы, трипсина.

Кровь в моче — гематурия. Аналогично протеинурии может быть почечная и внепочечная. Почечная обусловлена патологией почек. Внепочечная - патологией мочевыделительных путей.

13.РАСЧЕТ СУТОЧНОЙ ДОЗЫ ИНСУЛИНА ДЛЯБОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

До недавнего времени суточную дозу инсулина рассчитывали исходя из суточной глюкозурии или по содержанию глюкозы в крови. Однако в настоящее время, доза инсулина подбирается в зависимости от веса больного с учетом длительности заболевания.

Принцип метода: Для поддержания гомеостаза человеку необходимо в среднем 20-40 ЕД инсулина в сутки. Расчет суточной дозы инсулина (СДИ) больным производится исходя из расчета на фактическую

650