2 курс / Биохимия / Н.Ю.Коневалова - Биохимия

К безазотистым веществам слюны относятся липиды – холестерин и его эфиры, жирные кислоты, глицерофосфолипиды; углеводы – олигосахаридные компоненты муцинов, гликозаминогликаны, ди- и моносахариды, их продукты расщепления – лактат, пировиноградная кислота, уксусная, лимонная и другие органические кислоты.

В слюне также содержатся витамины С, В1, В2, В6, РР, Н, пантотеновая кислота; гормоны – катехоламины, кортикостероиды (кортизол, кортизон), прогестерон, эстрогены, тестостерон, АТФ, АДФ, АМФ, простагландины, биогенные амины.

Состав слюны изменяется в зависимости от характера пищи, состояния центральной нервной системы, скорости секреции, времени суток, возраста:

–При повышении скорости секреции в слюне увеличивается содержание Na, K – не изменяется, а I-снижается.

–К вечеру в слюне увеличивается содержание веществ, продуцируемых слюнными железами, и уменьшается количество компонентов микробного происхождения (самоочищение полости рта), к утру количество этих компонентов увеличивается.

–По мере старения организма снижается уровень хлора в слюне и в несколько раз увеличивается содержание кальция. Отсюда может идти образование зубного и слюнного камней.

–С возрастом уменьшается объем суточной секреции слюны, снижается активность ферментов.

Десневая жидкость: жидкое содержимое десневого желобка. В

сутки в ротовую полость поступает 0,5-2,5 мл этой жидкости, содержащей эпителий, лейкоциты, микроорганизмы, электролиты, белки, ферменты. В десневом желобке капилляры расположены под эпителием, и происходит транссудация содержимого капилляров в ротовую полость, включая даже некоторые белки крови. Возможен также обратный ток некоторых молекул из ротовой полости.

Таким образом, десневая жидкость у людей со здоровым пародонтом – это транссудат плазмы крови, и содержание минеральных веществ в ней такое же, как и в плазме. Микробный состав как в зубном налете. В жидкости содержатся ферменты, характерные для крови и для эпителия слизистой. Через десневой желобок в слюну поступают лейкоциты, что очень важно в антимикробной защите.

Жидкость вымывает различные частицы из десневого канала и предотвращает образование камней здесь

При поражении пародонта десневая жидкость образуется за счет осмотической экссудации продуктов обмена бактерий и компонентов зубного налета. В результате воспалительных процессов тканей могут развиваться аутоиммунные процессы, приводящие к нарушению связочного аппарата зубов, плохо поддающиеся лечению.

611

Зубной ликвор – это жидкость, заполняющая свободные пространства тканей зуба. С ней в зубные ткани поступают питательные вещества. Различают дентинный и эмалевый ликвор.

Дентинный ликвор составляет 12% от массы дентина и 20% от его объема. Содержит минеральные и органические вещества: до 92 мг/л Са, 42 мг/л фосфатов, ~28 мг/л Cl, белки, подобные белкам плазмы крови, аминокислоты, ферменты, витамины, микроэлементы. Ликвор движется в сторону эмали со скоростью ~4 мм/час и выполняет трофическую функцию. Изменение скорости и направления тока вызывают ощущение боли, чувство «оскомины».

Эмалевый ликвор меньше изучен, т.к. его очень мало – 6-11% объема эмали. Так как размеры микропространств в эмали очень малы, через кристаллы гидроксиапатита, как через сито, в эмалевую жидкость проходят только молекулы небольших размеров: минеральные вещества, микроэлементы, небольшие органические молекулы.

В глубоких зонах эмали ликвора находится больше, чем в поверхностных. С возрастом его количество уменьшается.

Пелликула зуба. Тонкий слой органических веществ, содержащий небольшое количество бактерий, остающийся после снятия зубного налета с поверхности эмали, называется пелликулой. Это структурный компонент зуба.

В ней содержатся белки с низким содержанием цистеина, метионина, не содержащие гидроксипролина и гидроксилизина, похожие на гликопротеины слюны (после отщепления остатков нейраминовой кислоты от углеводного компонента), подвергшиеся действию ферментов бактерий. В состав пелликулы также входят кислые фосфопротеины слюны и фрагменты стенок бактерий, пептиды, аминокислоты, аминосахара, сиаловые кислоты, кальций и другие минеральные вещества. В химическом отношении она представляет гликопротеиновый комплекс, в отличие от зубного налета не содержащий микробов. Образуется на поверхности эмали после прорезывания зуба и выполняет защитную функцию, снижая многократно растворимость эмали и предохраняя эмаль от действия органических кислот. Пелликула не стирается при жевании, чистке зубов и может быть удалена только при воздействии сильных абразивных агентов.

Зубной налет. Это мягкий слой органической матрицы и бактериальных клеток, откладывающийся на эмали поверх пелликулы. В отличие от пелликулы он удаляется при чистке зубов.

Химический состав зубного налета в разных участках полости рта варьирует в зависимости от возраста, диет, гигиенических навыков. В среднем он содержит 80% воды, 20% сухого остатка. 40% сухого остатка составляют минеральные вещества (фосфор, Na, К, Са, F, Zn, Fe) и 60% – органические (гликозаминогликаны, гликопротеины, оса-

612

ждаемые из слюны, полисахариды, синтезируемые бактериями из глюкозы – декстран-глюконы, из фруктозы – леваны, и гетерополисахариды).

При исключении углеводов из пищи полисахариды в матриксе зубного налета исчезают.

Быстрому развитию зубного налета способствует сахароза, она является предшественником для синтеза этих полисахаридов, а также стимулирует синтез ферментов у бактерий, осуществляющих образование полисахаридов. Содержание фтора в зубном налете может в 10-100 раз превышать его содержание в слюне и колеблется от 6 до 180 мг/кг. Фтор включается в него из пищи, воды, слюны, и может поступать из эмали при снижении рН зубного налета и активации процессов деминерализации эмали. Содержание фтора в зубном налете с возрастом увеличивается. Содержание минеральных веществ в налете достаточно высокое, они могут быть в виде гидроксиапатитов, фторапатитов, фторидов кальция и др.

Чем выше содержание Са и Р в зубном налете, тем меньше его кариесогенное действие. Зубной налет устойчив к смыванию слюной, полосканию полости рта, т.к. его поверхность покрыта слизистым полупроницаемым мукоидным гелем.

Он удаляется при чистке зубов щеткой, но уже через 2 часа начинает накапливаться. Сначала в нем преобладают аэробные микроорганизмы, а затем смесь аэробных и анаэробных. В 1 мг от 5 до 800 млн.

бактерий.

Полагают, что зубной налет защищает эмаль, т.к. его отсутствие приводит к эрозии и некрозу эмали.

Патогенное значение он приобретает при его больших скоплениях в углублениях, щелях, пришеечных участках зуба и уменьшении скорости слюноотделения.

Зубной камень – это твердое образование на поверхности зубов, возникающее чаще на язычной стороне зубов вблизи протоков слюнных желез. Зубной камень образуется в результате осаждения из слюны солей фосфатов и карбонатов кальция и магния в органическую матрицу зубного налета. С другой точки зрения – это минерализованная зубная бляшка, прикрепленная к эмали в области корня зуба.

По статистике зубной камень имеется у 75% людей, а при наличии гингивита – у 90% обследованных.

Взубном камне содержится:

–4-10% воды,

–13-25% органических веществ,

–72-82% минеральных веществ. Основные его компоненты – Са и Р.

Всильноминерализованных камнях содержится

613

–кальция – 29%,

–фосфатов – 16%.

В слабоминерализованных:

–кальция – 21%,

–фосфатов – 12%.

Также содержатся Mg, Na, Si, Zn, Pb, кадмий. Из органических

компонентов – аминокислоты; моносахариды (глюкоза, галактоза, галактозамин, глюкуроновая кислота); фосфолипиды, холестерин, ди- и триглицериды, жирные кислоты; ферменты; также входят остатки пищи, клетки эпителия, лейкоциты, микробы.

Образованию камня способствует снижение коллоидоустойчивости слюны в связи с изменением рН в щелочную сторону в результате накопления аммиака при действии уреазы на мочевину.

Зубной камень является частой причиной болезней пародонта, т.к. на его шероховатой поверхности задерживаются остатки пищи, микробы, эпителий, что способствует развитию и поддержанию воспаления. В свою очередь образованию камня может способствовать воспаление тканей пародонта (наряду с изменением химического состава слюны, накоплением зубного налета), т.е. возникает порочный круг.

Биохимия кариеса

Кариес зубов – одно из наиболее распространенных заболеваний, встречающееся у 98% людей.

На начальной стадии на гладкой поверхности зуба появляется белое пятно («меловое»), где эмаль теряет блеск вследствие увеличения пористости ее и поэтому увеличения рассеивания света. Эта пористость возникает вследствие действия органических кислот, образующихся при расщеплении глюкозы ферментами бактерий зубного налета.

В местах скопления зубного налета (адсорбирующего сахарозу) ферменты бактерий расщепляют пелликулу, и органические кислоты проникают к эмали, происходит ее деминерализация, формируется дефект, куда проникают бактерии.

Дентин и пульпа имеют клетки, которые реагируют на повреждение образованием вторичного дентина, минерализацией дентиновых канальцев. Происходит воспаление твердых тканей зуба – потеря карбонатных ионов, кальция, магния.

Способствуют развитию кариеса:

–снижение скорости слюноотделения;

–увеличение вязкости слюны и повышение содержания в ней муцинов;

–сдвиг рН слюны в кислую сторону;

–снижение степени насыщенности слюны соединениями Са и Р

614

вследствие сдвига рН в кислую сторону;

–активация ферментов катаболизма глюкозы в слюне и зубном налете (микробного происхождения).

Особенно благоприятная ситуация для развития кариеса складывается во время сна, когда накапливается молочная кислота вследствие гликолиза.

–Потребление больших количеств чистых сахаров.

–Недостаточное поступление фтора в организм.

Фтор – важный элемент, присутствие которого необходимо для

правильного формирования костей и зубов. Фтор соединяется с гидроксиапатитом с образованием фторапатита:

Кристаллы фторапатита среди кристаллических компонентов составляют очень небольшую долю, однако они придают кристаллам гидроксиапатита прочность и кислотоустойчивость.

Натуральные, а тем более рафинированные продукты питания не всегда содержат достаточные количества фторидов. Для нас главным источником фторидов является питьевая вода. Оптимальное содержание F в питьевой воде – 0,7-1,5 мг/л. Содержание в сыворотке крови в норме

– 1,0 мкмоль/л, зависит от содержания в питьевой воде. 99% всего F находится в организме в минерализованных тканях (зубах, костях).

Исследования, проводимые в США, показали, что добавление в воду фтора в концентрации 1 часть на 1000000 значительно снижает вероятность развития кариеса. Поэтому многие водопроводные компании сейчас проводят фторирование водопроводной воды.

Избыточное поступление фтора в организм вредно и вызывает флюороз, для которого характерно развитие крапчатости зубов.

615

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Белки, строение, функции

1. Напишите тетрапептид асп-фен-глн-гис. В какой области рН данный пептид будет находиться в изоэлектрическом состоянии?

Ответ: Данный пептид находится в изоэлектрическом состоянии при рН≤7.

2.Смесь аминокислот, содержащая валин, лейцин, аспарагиновую кислоту, лизин, гистидин, серин была подвергнута фракционированию методом электрофореза на бумаге при рН=6,2. Какие аминокислоты будут перемещаться к катоду, аноду или останутся на линии старта?

Ответ: На линии старта останутся – вал, лей, сер. К катоду будут передвигаться – лиз, гис. К аноду будут передвигаться – асп, глу.

3.Почему белок молока (казеин) сворачивается (т.е. выпадает в осадок), если молоко кислое?

Ответ: В результате потери двух факторов устойчивости белка в растворе – заряда (изоэлектрическая точка белков молока ниже рН=7,0) и гидратной оболочки.

4.В какой последовательности будут выходить из колонки при гель-фильтрации на сефадексе белки со следующими молекулярными массами?

1)иммуноглобулин А – 500 000; 2) фибриноген 330 000; 3) трансферрин – 75 000; 4) ретинол-связывающий белок – 24 000; 5) транскортин – 55 000?

Ответ: 1, 2, 3, 5, 4.

5.Пепсин желудочного сока (рН 1,5) имеет изоэлектрическую точку около 1,0, что намного ниже, чем у других белков. Какие функциональные группы должны присутствовать в пепсине в относительно большом количестве, чтобы фермент мог иметь такую низкую изоэлектрическую точку? Какие аминокислоты имеют эти группы в своем составе?

Ответ: В пепсине присутствуют в большом количестве карбоксильные группы. В составе пепсина большое количество кислых аминокислот – аспарагиновой и глутаминовой.

6. Большинство глобулярных белков при кратковременном нагревании до 650С денатурирует. Однако те глобулярные белки, в которых содержится много остатков цистеина, денатурируют только при более длительном нагревании до более высоких температур. Какова молекулярная основа этого?

Ответ: Остатки цистеина препятствуют полному развертыва-

616

нию молекул белка.

7. Напишите тетрапептид мет-тир-лиз-глу. В какой области рН данный пептид будет находиться в изоэлектрическом состоянии?

Ответ: Данный пептид находится в изоэлектрическом состоянии при рН ≤ 7.

8. Напишите тетрапептид арг-ала-лиз-мет. В какой области рН данный пептид будет находиться в изоэлектрическом состоянии?

Ответ: Данный пептид находится в изоэлектрическом состоянии при рН > 7.

9. Почему при добавлении к водному раствору белка нейтральных солей в высокой концентрации белок выпадает осадок?

Ответ: При добавлении высоких концентраций солей из молекул белка удаляется гидратная оболочка, в результате чего растворимость белка уменьшается.

Ферменты

1. Измеряя скорость ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата в отсутствии и в присутствии ингибиторов (А и В) были получены следующие данные:

Определите тип ингибирования в каждом случае, объясните свое заключение. В каком случае добавление субстрата может снять ингибирующий эффект?

Ответ: Без ингибитора: Vmax – 40 ммоль/л, Km – 1×10–5 М. В присутствии ингибитора А: Vmax – 40 ммоль/л, Km – 2×10–5 М. В при-

сутствии ингибитора В: Vmax – 30 ммоль/л, Km – 1×10–5 М. Вывод: ингибитор А – конкурентный, ингибитор В – неконкурентный. В случае ингибитора А добавление субстрата до концентрации 5×10-5 М может снять ингибирующий эффект.

2. Высокая токсичность метанола обусловлена действием продукта его метаболизма – формальдегида, который образуется при окислении метанола под действием алкогольдегидрогеназы. Один из

617

методов лечения при отравлении метанолом состоит в том, что больному назначают этанол (внутрь, внутривенно). Объясните механизм лечебного действия этанола в данном случае. Имеет ли значение количество вводимого этанола и почему?

Ответ: Этанол конкурирует с метанолом за активный центр алкогольдегидрогеназы, препятствуя наработке формальдегида. Преимущественное связывание алкогольдегидрогеназы с этанолом будет лишь при концентрации, превышающей концентрацию этанола. Поэтому доза вводимого этанола должна быть достаточно высокой.

3.Как удалить кофермент от апофермента? Ответ: Методом диализа или гель-фильтрации.

4.Кислая фосфатаза из простаты ингибируется тартрат-ионами,

аиз других органов этот фермент не ингибируется тартрат-ионами. Как это можно использовать в диагностике рака простаты?

Ответ: Анализ активности фермента проводят в присутствии и в отсутствие тартрата. Разность между результатами измерений в этих двух пробах характеризует тартратчувствительную кислую фосфатазу простаты. При раке простаты активность тартратчувствительной кислой фосфатазы резко возрастает.

5. Чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду, а затем охлаждают в холодной воде. Кукуруза, обработанная таким образом и хранящаяся в замороженном виде, сохраняет свой сладкий вкус. В чем биологическая основа этой обработки?

Ответ: Фермент, ответственный за превращение сахара в крахмал, инактивируется при нагревании.

6. В лаборатории два студента независимо друг от друга выделили фермент лактатдегидрогеназу (из сердца цыпленка), восстанавливающую пируват в лактат. Фермент был получен в виде концентрированного раствора. Затем оба студента измерили ферментативную активность полученных ими растворов и определена Vmах, Кm и удельная активность. При сравнении результатов оказалось, что значения Кm у них совпадали, а удельная активность у одного была равна 100, а у другого – 150. Чем отличались выделенные ферменты?

Ответ: Степенью очистки. У первого студента фермент был хуже очищен от белков, вследствие чего оказалась ниже удельная активность.

Энергетика

1. Известно, что окисление сукцината с помощью ФАДзависимых дегидрогеназ характеризуется ∆G=-0,9 ккал, а окисление с

618

помощью НАД-зависимых дегидрогеназ ∆G=+16,1 ккал. Что является более подходящим акцептором для электронов при дегидрировании сукцината, почему?

Ответ: ФАД, так как отрицательное значение ∆G свидетельствует об экзергонической реакции. Окисление сукцината НАД-зависимы- ми дегидрогеназами требовало бы дополнительной энергии.

2.Напишите суммарное уравнение реакции окисления изолимонной кислоты (изоцитрат) в суспензии митохондрий, содержащей избыток неорганического фосфата, АДФ при добавлении малоновой кислоты (малонат) и 2,4-динитрофенола. Объясните механизм действия малоната и 2,4-динитрофенола.

Ответ: Изоцитрат+Фн+АДФ→сукцинат+2СО2+АТФ. Малонат – конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы, поэтому будут протекать реакции от изоцитрата только до сукцината. 2,4-динитрофенол

–протонофор, разобщитель дыхания и фосфорилирования, поэтому образуется лишь одна молекула АТФ методом субстратного фосфорилирования.

3.Почему прием внутрь разобщителей тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования вызывает обильное потоотделение и повышение температуры тела. Объясните это явление на молекулярном уровне. Как изменяется отношение Р/О в присутствии разобщающих агентов?

Ответ: В присутствии разобщителей энергия электрохимического потенциала рассеивается в виде тепла. Коэффициент Р/О уменьшается.

4. В эксперименте с изолированными митохондриями в качестве окисляемого субстрата использовали малат. Как изменится коэффициент Р/О, если: а) в инкубационную смесь добавить ингибитор НАДН-дегидрогеназы; б) вместе с ингибитором добавить сукцинат?

Ответ: а) окислительное фосфорилирование не происходит, т.е. коэффициент Р/О равен 0; б) сукцинат окисляется в укороченной дыхательной цепи, поэтому коэффициент Р/О будет равен 2.

5. Многие организмы (ряд бактерий, дрожжи, паразитирующие черви) не нуждаются в кислороде. Какой из известных двух способов образования АТФ используется в этих организмах для аккумуляции энергии?

Ответ: субстратное фосфорилирование.

Обмен углеводов

1. У больного ребенка с умственной отсталостью молоко вызывает понос и рвоту. В плазме крови обнаружена низкая концентрация

619

глюкозы, но высокое содержание редуцирующих сахаров. В моче обнаруживается галактоза. Объясните почему в плазме крови наблюдается высокое содержание редуцирующих сахаров, а в моче обнаруживается галактоза?

Ответ: Недостаточность галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы приводит к накоплению в тканях и плазме крови галактозы. Увеличение уровня редуцирующих сахаров обусловлено накоплением галактозы в плазме крови. Избыток галактозы удаляется мочой.

2. Больной ребенок не переносит молока. Как только он его выпьет, начинается рвота и понос. При проведении теста на толерантность к лактозе (больной получает определенное количество лактозы, а затем через определенные промежутки времени определяют концентрацию глюкозы и галактозы в сыворотке крови; в норме – через час уровень их возрастает, а затем снижается) установлено, что у больного концентрация галактозы и глюкозы в крови не увеличивалась, а оставалась постоянной. Почему у больного не происходит изменений в содержании сахаров в крови?

Ответ: Недостаточность лактазы кишечного сока. Исключить лактозу (молоко) из диеты.

3. Возможен ли синтез глюкозы из пирувата, если цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование полностью ингибированы?

Ответ: Нет. Для глюконеогенеза необходима энергия АТФ и ГТФ и восстановительные эквиваленты (НАДН+Н+). Энергия и восстановительные эквиваленты образуются в цикле трикарбоновых кислот и в процессе окислительного фосфорилирования при катаболизме аминокислот, жирных кислот или углеводов.

4. Как влияет повышение концентраций АТФ и АМФ на каталитическую активность фосфофруктокиназы?

Ответ: Фосфофруктокиназа активируется при повышении концентрации АМФ и ингибируется при повышении концентрации АТФ.

5. Чем обусловлено быстрое повышение лактата в крови при физической нагрузке? Что является причиной снижения уровня лактата после физической нагрузки?

Ответ: Повышение концентрации лактата обусловлено увеличением скорости гликолиза. Причиной снижения уровня лактата является превращение лактата в глюкозу через пируват.

6. Может в клетках животных лактат образоваться из жирных кислот?

Ответ: Нет, так как жирные кислоты распадаются до ацетил-КоА, который не превращается в пируват, а значит и лактат.

620