2 курс / Биохимия / Н.Ю.Коневалова - Биохимия

Видимый свет – это форма электромагнитного излучения с длиной волны от 400 до 700 нм. Своим происхождением он обязан процессам слияния ядер атомов водорода на Солнце (при t0 ~ 20.000.000 К), в результате чего образуются атомы гелия и электроны с выделением части энергии в виде фотонов – квантов видимого света.

Вещества способны поглощать свет в зависимости от их атомной структуры – расположения электронов вокруг ядра. Электроны поглощают фотоны с определенной длиной волны, что и обусловливает спектр поглощения соединений.

Когда фотон сталкивается с атомом или молекулой, его энергия поглощается одним из электронов. Атом или молекула при этом переходят в состояние возбуждения, более богатое энергией. Возбудить атом или молекулу могут только фотоны с определенной длиной волны. Возбуждение происходит почти мгновенно, менее 10-15 сек. Возбужденные молекулы крайне неустойчивы – время их жизни в этом состоянии всего 10-9 – 10-8 сек. При прекращении действия света молекула возвра-

581

щается в свое основное состояние – с более низкой энергией. Энергия, поглощенная молекулой, может выделиться в виде тепла, света (флуоресценция).

Стадии фотосинтеза

Процесс фотосинтеза осуществляется путем световых фотохимических и темновых ферментативных реакций.

Световая стадия. Характеристика фотосистем. В световой ста-

дии участвуют две фотосистемы, представляющие функциональные ансамбли светопоглощающих пигментов: фотосистема I и фотосистема II.

Функциональная единица фотосистемы I содержит около 200 молекул хлорофилла «а» и 50 молекул каротиноидов. Эти пигменты являются фотосборщиками энергии, т.е. поглощают фотоны. На этот ансамбль имеется одна молекула пигмента Р700, играющего роль реакционного центра.

Фотосистема II включает пигменты фотосборщики – около 200 молекул хлорофилла «а», 200 молекул хлорофилла «b», фикобилины или ксантофиллы. Реакционным центром системы является молекула пигмента Р680. Фоторецепторы поглощают кванты света и передают свою энергию возбуждения к реакционному центру – месту, где протекают химические реакции.

В реакционных центрах находятся хлорофиллы с особыми свойствами, обусловленными их окружением. Полагают, что это агрегированная форма хлорофилла «а». Имеются хлорофиллы с максимумом поглощения при длине волны 700 нм и 680 нм, поэтому они названы пигментами Р700 и Р680, т.е. это фотохимически активная форма хлорофилла. На их долю приходится 1/400 часть общего хлорофилла в клетке.

Энергетический уровень возбужденного состояния Р700 и Р680 ниже, чем у других хлорофиллов – фоторецепторов, поэтому они способны забирать энергию возбуждения от фотосборщиков в виде экситонов.

Перенос энергии к реакционному центру идет очень быстро – менее

10-10 сек.

В тилакоидах локализованы обе фотосистемы, в ламеллах - только I. Фотосистема I более древняя в эволюционном отношении, есть у всех фотосинтезирующих клеток. Фотосистема II появилась позднее. В состав обеих фотосистем кроме пигментов входят еще переносчики электронов.

Полный набор пигментов и переносчиков электронов обеих фотосистем составляет структурный и функциональный ансамбль, называемый квантосомой (м.м. около 2 млн Да, длина около 17,5 нм).

582

Потеря молекулой Р700 электрона приводит к переходу его в окисленное состояние, т.е. возникает электронная дырка, подлежащая заполнению. В заполнении дырки участвуют фотосистема II и цепь переносчиков электронов, связывающая обе фотосистемы.

При освещении фотосистемы II экситоны фотосборщиков поглощаются пигментом Р680, который переходит в возбужденное состояние. ОВП Р680 в основном состоянии равен + 1,0 в. Возбуждение молекулы приводит к сдвигу ОВП до – 0,06 в (т.е. на 1,0 в), в результате чего п о- является способность к отдаче электрона. От Р680 электроны переносятся на Q – прочно связанную молекулу пластохинона (ОВП = - 0,06 в), с нее на подвижный (свободный) пластохинон (ОВП = 0,08), далее на цитохром b559 (цит.f – от латинского frons – листья, ОВП = + 0,01 – 0,02 в). От него электроны переходят на цитохром с552 (ОВП = + 0,365 в), являющийся интегральным мембранным белком. Он передает электроны пластоцианину – белку с м.м. 10500 Да, имеющему атом меди, который расположенн вблизи поверхности молекулы и связанн с остатками цистеина и метионина (ОВП = + 0,4 в). Локаль ное натяжение при атоме меди облегчает перенос электронов на окисленную форму Р700. Но т е- перь возникает дефицит электронов у Р680. Заполнение электронной дырки происходит за счет электронов воды (Е0 = + 0,82 в). Потенциал Р680 более положителен, чем воды. В результате перехода электронов на пигмент Р680 выделяются кислород и протоны, которые присоединяются к НАДФ, принявшему электроны, а сам процесс разложения воды получил название фотолиза.

Таким образом, свет вызывает перенос электронов от воды (Е0 = + 0,82 в) к НАДФ (Е 0 = - 0,32 в), т.е. против градиента химического потенциала, что отражает схема взаимосвязи фотосистем и цепей переноса электронов. Фактически для того, чтобы бедные энергией электроны воды оказались способными восстановить НАДФ, каждый электрон должен быть дважды «подброшен» вверх. В каждой фотосистеме на один «подброшенный вверх» электрон расходуется один квант или фотон. После этого электроны с избыточной энергией устремляются вниз по системе переносчиков по градиенту потенциала. На каждый электрон, переходящий от воды к НАДФ, поглощаются два кванта света (по одному каждой фотосистемой).

Для образования молекулы О2 при фотолизе воды к НАДФ должны быть переданы четыре электрона, т.е. должно быть поглощено восемь квантов (по четыре каждой фотосистемой).

Рассмотренный перенос электронов с восстановлением НАДФ называется нециклическим путем.

584

Фотосинтетическое фосфорилирование

Во время перехода электронов из фотосистемы II в фотосистему I происходит фосфорилирование АДФ с образованием АТФ.

Схема фотосинтетического фосфорилирования в хлоропластах

тилако ид

Это означает, что часть световой энергии, улавливаемой фотосистемами, трансформируется в энергию макроэргических связей АТФ. Этот процесс стали называть фотосинтетическим фосфорилированием. Перенос электронов через асимметрично ориентированные фотосистемы I и II создает большой протонный градиент.

Фотосинтетический перенос электронов и фотофосфорилирование в хлоропластах во многом сходны с переносом электронов и окислительным фосфорилированием в митохондриях. Сходство проявляется

вследующем:

1.реакционные центры (Р700 и Р680), переносчики электронов и ферменты, участвующие в образовании АТФ, находятся в мембране тилакоидов;

2.необходимое условие – целостность мембраны тилакоида;

3.тилакоидная мембрана непроницаема для протонов;

4.фотофосфорилирование можно заблокировать или разобщить теми же реагентами, что и окислительное;

5.синтез АТФ осуществляется ферментным ансамблем - ком-

плексом CF1-CF0, похожим на АТФ-азу митохондрий, поэтому его назвали СF (от англ. chloroplast). CF1 – «грибовидные» молекулы из 5 типов субъединиц, расположенные на наружной поверхности тилакоид-

585

ной мембраны и обращенные в строму хлоропласта (подобно головке АТФ-азы митохондрий, обращенной в матрикс). Они катализируют образование АТФ из АДФ и неорганического фосфата. СF0 – протонный канал, образованный тремя видами субъединиц и проходящий через мембрану тилакоида.

Отличительной особенностью мембраны тилакоида является ее проницаемость для ионов хлора и магния.

В создании протонного градиента имеют значение и фотолиз воды, происходящий во внутреннем пространстве тилакоида, и перенос электронов пластохиноном. Тилакоидная мембрана, подобно внутренней мембране метохондрий, асимметрична по молекулярному строению, а свободный пластохинон, участвующий в переносе электронов между второй и первой фотосистемами, подобен убихинону, плавающему во внутренней мембране митохондрии. Взяв электроны, пластохинон забирает протоны у воды стромы и перекачивает их внутрь тилакоида (как убихинон в межмембранное пространство митохондрии). За счет этого и фотолиза воды в полости тилакоида среда становится кислой, рН приближается к 4,0 – 3,5.

Изучая окислительное фосфорилирование, мы выражаем электрохимический потенциал уравнением µн = Δφ + рН. В хлоропластах почти вся величина µн+ создается градиентом рН, а не электрическим потенциалом, как в митохондриях. Причина отличия в том, что в р е- зультате проницаемости мембраны тилакоида для ионов хлора и магния, увеличение протонного градиента в полости тилакоида сопровождается либо переносом хлора в том же направлении (Cl-), либо переносом иона магния (Mg2+) на 2 протона в строму (т.е. противоположном направлении). Этим поддерживается электронейтральность и не возникает большой величины электрического потенциала.

Возникающий протонный градиент запускает синтез АТФ. При прохождении через комплекс CF0 – CF1 трех протонов синтезируется молекула АТФ, что соответствует потреблению 60,2 кДж. Синтезированная АТФ высвобождается в матрикс. Поступившие в матрикс протоны соединяются с НАДФ2-, восстановленным электронами. Образуется НАДФН + Н+. Конечные продукты световой стадии АТФ, НАДФН +

Н+, обладающие запасом энергии и восстановительными свойствами, обеспечивают последующие темновые реакции превращения СО2 в углеводы. Кислород выделяется в атмосферу.

Возможен также и другой путь переноса электронов с пигмента

Р700 не на НАДФ, а через цитохром b563 на цитохром с552 и далее на пластоцианин. С него электроны возвращаются к Р700 и заполняют элек-

тронную дырку. Происходит генерирование энергии в АТФ (разница ОВП переносчиков электронов превышает 0,2 в), но без образования НАДФН + Н+. Этот процесс получил название циклического фото-

586

фосфорилирования. Вторая фотосистема в нем не участвует. Оно функционирует в растительной клетке тогда, когда она вполне обеспечена НАДФН + Н+, т.е. восстановительными эквивалентами, но для метаболических целей нужна АТФ.

Параллельно с процессом фотосинтеза на свету может происходить и дыхание. Оно не сопровождается окислительным фосфорилированием и направлено на использование НАДФН + Н+ на восстановление молекулярного кислорода. Его функция не ясна. Возможно, что оно используется как предохранительный клапан для поддержания определенного уровня восстановительных эквивалентов.

Темновая стадия фотосинтеза

Протекает в матриксе (строме) хлоропласта, где ситезированные на свету АТФ и НАДФН + Н+ используются для связывания СО2 и восстановления его до углеводов.

В соответствии с общим уравнением фотосинтеза

6 СО2 + 6 Н2О С6Н12О6 + 6 О2

изменение стандартной свободной энергии для синтеза одной молекулы глюкозы составляет + 686 ккал/моль (2867,5 кДж). Обратное этому процессу окисление глюкозы сопровождается уменьшением свободной энергии на эту же величину.

Какое же количество энергии должна поставить световая стадия для удовлетворения этой эндергонической реакции?

Мы уже рассчитали, что для переноса одного электрона от Н2О к НАДФ должны быть поглощены два кванта света, по одному на каждую фотосистему. Образование одной молекулы кислорода требует четырех электронов, т.е. поглощения восьми квантов. Для выделения шести молекул кислорода нужны 48 квантов. Энергия одного «моля» квантов колеблется от 72 ккал (301 кДж) при 400 нм до около 41 ккал (171,4 кДж) при 700 нм. Таким образом, зеленым клеткам для синтеза одного моля глюкозы требуется в зависимости от длины волны поглощаемого света от 48 · 41 = 1968 ккал (8226 кДж) до 48 · 72 = 3456 ккал (14446 кДж).

Опыты с использованием 14С показали, что СО2 присоединяется к рибулозо-1,5-бисфосфату при участии рибулозо-1,5-бисфосфаткар- боксилазы, которая локализована на внешней поверхности мембран тилакоидов, обращенной к матриксу. Фермент составляет 1/6 часть всех белков хлоропласта (т.е. содержится в очень большом количестве).

Фермент осуществляет карбоксилирование и гидролитическое расщепление с образованием двух молекул 3-фосфоглицериновой кислоты.

587

Рибулозо-1,5-бисфосфат вступает в процесс и в конце регенерируется. В этом процессе, получившем название цикла Кальвина, сочетаются реакции гликолитического превращения углеводов и пентозного пути.

O

СН 12 Н С ОН

СН2ОРО3Н2

3-фосфоглицериновый альдегид

Восстановление 1,3-бисфосфоглицериновой кислоты в 3- фосфоглицериновый альдегид катализирует глицеральдегид-3-фосфат- дегидрогеназа, специфичная в отношении к НАДФ – Н + Н+. Дальнейшие стадии приводят к образованию молекулы глюкозы и 6 молекул рибулозо-5-фосфата (см. схему), на фосфорилирование которых затрачивается еще 6 АТФ. Таким образом, регенерируется 6 молекул рибуло- зо-1,5-бисфосфата.

588

Син тез гексо з и реген ерация рибуло зо -1,5-бисф о сф ата

6 рибуло зо -1,5-бисф о сф ат

Суммарное уравнение процесса:

6 рибулозо-1,5-бисфосфат + 6 СО2 + 18 АТФ + 12 НАДФН – Н+ глюкоза + 6 рибулозо-1,5-бисфосфат + 18 АДФ + 18 Н3РО4 + + 12 НАДФ

589

В итоге на каждую молекулу СО2 расходуется 2НАДФ Н + Н+

и 3 АТФ. Первичным продуктом при ассимиляции СО2 является 3- фосфоглицериновая кислота, а другие органические вещества являются продуктами ее преобразований.

Регуляция фотосинтеза

Метаболический тип регуляции основан на аллостерической регуляции активности ферментов: рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы (главный), альдолазы, седогептулозо-бисфосфатазы и других.

Регуляция рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы

2.Mg2+

3.подщелачивание матрикса за счет

ухода протонов в полость тилакоида

4.фруктозо-6-фосфат

рибуло зо - 1,5 - бисф о сф аткарбо ксилаза

Свет активирует образование восстановленного ферредоксина, он активирует фосфатазу фруктозо-1,6-бисфосфата. Образующийся фрук- тозо-6-фосфат стимулирует рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу.

В темноте бисфосфатаза неактивна. Накапливается фруктозо-1,6- бисфосфат, который ингибирует карбоксилазу.

Бесхлорофильный фотосинтез

В1976 году Стокениус обнаружил, что галлобактерии, живущие

взасоренных водоемах, осуществляют бесхлорофильный фотосинтез благодаря белку родопсину, содержащему ретиналь. Бактериородопсин насквозь пронизывает мембрану и, поглощая свет, перекачивает прото-

590