Определение пировиноградной кислоты в моче колориметрическим методом

Принцип метода. Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде приобретает красно-коричневую окраску, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации ПВК.

Уравнение реакции.

ПВК 2,4-динитрофенилгидразин 2,4 –динитрофенил

фенилгидразон ПВК

Реактив

ы и оборудование.

1. 2,4-Динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ), 0.1% раствор в 2н HCl.

2. Гидроксид калия (КОН), 2,5% раствор в этиловом спирте.

3. Пробирки с пробками, пипетки.

4. Фотоэлектроколориметр.

5. Калибровочный график.

Ход работы.

К 1 мл разведенной в 4 раза мочи добавляют 0,5 мл 0,1% раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ). Параллельно готовят контрольную пробу, содержащую 1 мл дистиллированной воды вместо мочи; все остальные реактивы добавляют в том же количестве, что и в опытную пробу. К контрольной и опытной пробе через 5 минут добавляют 3 мл 2,5% спиртового раствора гидроксида калия и перемешивают. Через 10 минут пробы фотометрируют, используя зеленый светофильтр (l=560 нм) и кюветы с рабочим расстоянием 10 мм, против контроля.

Расчет.

Калибровочный график зависимости оптической плотности окрашенного раствора гидразона от концентрации ПВК в пробе D=f( C) строят предварительно, используя стандартный раствор пирувата натрия. Полученное по графику количество ПВК в мkг (Х) подставляют в формулу

Содержание ПВК в суточном объеме мочи (С, мг/сут) :

С=Х*4*1500/1000,

где Х - содержание ПВК в исследуемой пробе, определенное по калибровочному графику, мкг/мл;

4 – множитель для определения содержания ПВК в 1 мл неразведенной мочи;

1500 – средний суточный объем мочи, мл;

1000 – коэффициент для перевода мкг в мг.

Сравните полученные результаты с нормой: за сутки с мочой должно выделяться 10-25 мг ПВК. Укажите возможные причины повышенного содержания ПВК в моче.

Вывод

Тестовый контроль по теме « Дихотомическое расщепление глюкозы. Глюконеогенез. Обмен пировиноградной кислоты.»

Тест 1

Выберите правильный ответ

Гликолиз - это ферментативный процесс расщепления глюкозы:

а) до СО₂ и Н₂О

б) анаэробного апотомического

в) аэробного дихотомического

г) анаэробного дихотомического

д) аэробного апотомического

Тест 2

Выберите правильный ответ

Конечным продуктом гликолиза является:

а) молочная кислота

б) пировиноградная кислота

в) две триозы: глицеральдегид-3-фосфат, диоксиацетонфосфат

г) ацетил-коА

д) лимонная кислота

Тест 3

Выберите правильный ответ

Реакция, определяющая скорость гликолиза:

а) гексокиназная

б) альдолазная

в) глицеральдегидфосфатдегидрогеназная

г) лактатдегидрогеназная

д) фосфофруктокиназная

Тест 4

Выберите все правильные ответы

Пировиноградная кислота в клетках может:

а) подвергаться окислительному декарбоксилированию в аэробных условиях до ацетил-коА

б) восстанавливаться в анаэробных условиях до лактата

в) превращаться в аланин в реакции трансаминирования

г) являться субстратом глюконеогенеза

д) являться конечным продуктом глюконеогенеза

Тест 5

Выберите все правильные ответы

Реакции гликолиза,являющиеся необратимыми:

а) лактатдегидрогеназная

б) пируваткиназная

в) альдолазная

г) фосфофруктокиназная

д) гексокиназная

Тест 6

Выберите все правильные ответы

Ферменты глюконеогенеза, являющиеся ключевыми:

а) фруктозо - 1,6 - дифосфатаза

б) пируватдегидрогеназа

в) пируваткарбоксилаза

г) глюкозо – 6 - фосфатаза

д) фосфоенолпируваткарбоксикиназа

Тест 7

Выберите правильный ответ

Субстратное фосфорилирование - это:

а) фосфорилирование глюкозы с участием АТФ

б) фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с участием АТФ

в) образование двух фосфотриоз в альдлланой реакции

г) синтез АТФ (ГТФ и др.) с использованием энергии макроэргичес-

ких связей субстратов

д) синтез АТФ в дыхательной цепи

Тест 8

Выберите правильный ответ

Инсулин регулирует процесс глюконеогенеза:

а) индуцируя синтез глюкокиназы

б) индуцируя синтез ключевых ферментов процесса глюконеогенеза

в) вызывает репрессию синтеза фруктозо - 1,6 - дифосфатазы, глюкозо – 6 –фосфатазы, фосфоенолпируваткарбоксикиназы

г) индуцируя синтез ацетил-коА-карбоксилазы

д) подавляя активность глюкокиназы

Тест 9

Выберите все правильные ответы

Условия протекания окислительного декарбоксилирования пирувата:

а) целостность митохондриальных мембран

б) достаточная концентрация ацетил-коА, АТФ и восстановленных коферментов

в) отсутствие воздействия тиоловых ядов

г) достаточное количество витамина В1

д) наличие кислорода в клетке

Тест 10

Выберите все правильные ответы

Окислительное декарбоксилирование пирувата завершается образованием:

а) лактата

б) ацетил-коА

в) восстановленного кофермента НАДН+Н⁺

г) оксалоацетата

д) углекислого газа

Тест 11

Установите строгое соответствие

( один вопрос - один ответ )

Коферменты пируватоксидазной системы	Вещества, входящие в состав коферметов
1) ТДФ 2) Липоевая кислота 3) HS – KoA 4) ФАД 5) НАД+	а) вит. В1 б) вит. В2 в) вит. В5 г) вит. РР д) вит. В6 е) витаминоподобное вещество

Тест 12

Установите строгое соответствие

( один вопрос - один ответ )

Ферменты пируватоксидазной системы:	Простетические группы ферментов:
1) пируватдегидрогеназа 2)дигидролипоилацетилтрансфераза 3) дигидролипоилдегидрогеназа	а) HS – KoA б) ТДФ в) липоевая кислота г) ФАД

Тест 13

Установите строгое соответствие

( один вопрос - один ответ )

Превращения ПВК:	Название процессов:
1) восстановление до лактата 2) карбоксилирование с образованием оксалоацетата 3) превращение в аланин 4) образование ацетил-коА	а) глюконеогенез б) гликолиз в) окислительное декарбоксилирование г) трансаминирование д) гликогенолиз

Тест 14

Установите строгое соответствие

(один вопрос - один ответ)

Субстраты гликолиза	Продукты их превращения
1) глюкозо - 6 - фосфат 2) глицеральдегид - 3 - фосфат 3) фосфоенолпируват 4) глюкоза	а) диоксиацетонфосфат б) фруктозо – 6 – фосфат в) пируват г) 1,3 - дифосфоглицерат д) глюкозо - 6 - фосфат

Тест 15

Установите строгое соответствие

(один вопрос - один ответ)

Реакции гликолиза:	Биологическое значение :
1) фосфорилирование глюкозы с помощью АТФ 2) превращение фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат 3) превращение фосфоенолпирувата в пируват	а) реакция субстратного фосфорилирования б) завершающая реакция подготовительного этапа гликолиза в) образование активной формы глюкозы г) скорость определяющая реакция

Тест 16

Дополните

Завершающая реакция гликолиза:

_____ + _____ = _____ + ________

Тест 17

Дополните

Скоростьопределяющая реакция гликолиза:

_____ + _______ → _______ + _______

Тест 18

Дополните

Образование активной формы глюкозы:

______ + _____ → ______ + _______

Тест 19

Дополните

Уравнение реакции, завершающей подготовительный этап гликолиза:

_______________ → ________ + _________

Тест 20

Дополните

Суммарное уравнение окислительного декарбоксилирования пирувата:

______ + _______ + _____ → _______ + _______ + _______

Тест 21

Дополните

Этап гликолитической оксидоредукции начинается с реакции:

______ + ______ + ______ → ______ + _______

Тест 22

Дополните

Биороль реакций субстратного фосфорилирования заключается

в синтезе ______ с использованием энергии ________ связи субстрата

Тест 23

Дополните

Глюконеогенез - это процесс синтеза ________ из _________ веществ

Тест 24

Дополните

Механизм инактивирования пируватоксидазного комплекса тиоловыми ядами заключается в блокировании __________ тиоловых ферментов и коферментов

Тест 25

Выберите все правильные ответы

Ингибиторы пируватоксидазной системы

а) СО б) СN в) Hg г) Н₂О₂ д) моноиодацетат

Тест 26

Выберите все правильные ответы

Ферменты пируватоксидазной системы:

а) дигидролипоилдегидрогеназа

б) пируваткиназа

в) дигидролипоилацетилтрансфераза

г) пируватдегидрогеназа

д) пируваткарбоксилаза

Тест 27

Выберите правильный ответ

Клетки, которые существуют только за счет гликолиза

а) гепатоциты

б) кардиомиоциты

в) эритроциты

г) лейкоциты

д) адипоциты

Тест 28

Дополните

В процессе гликолиза в расчете на одну молекулу глюкозы образуется ________ молекулы АТФ, а в процессе гликогенолиза ______

Тест 29

Дополните