Негистоновые белки

Негистоновые белки составляют около 20% от всех белков хроматина. По определению, негистоновые белки – это все белки хроматина, кроме гистонов, выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. Около 80% из негистоновых белков относится к белкам ядерного матрикса, обнаруживаемых как в составе интерфазных ядер, так и митотических хромосом. Эта группа белков будет отдельно рассмотрена в разделе, посвященном комплексу структур, входящих в состав ядерного матрикса: фиброзный слой или ламина ядерной оболочки и внутренний ядерный матрикс, интерхроматиновая сеть, матрикс ядрышка.

Во фракцию негистоновых белков может входить около 450 индивидуальных белков с различной молекулярной массой (5-200 кД). Часть этих белков водорастворима, часть растворима в кислых растворах, часть непрочно связана с хроматином и диссоциирует при 0,35 М концентрации солей (3 М NaCI) в присутствии денатурирующих агентов ( 5 М мочевина). Поэтому характеристика и классификация этих белков затруднена, а сами белки еще недостаточно изучены.

Среди негистоновых белков обнаруживается целый ряд регуляторных белков как стимулирующих инициацию транскрипции, так и ингибирующих ее, обнаружены белки специфически связывающиеся с определенными последовательностями на ДНК. К негистоновым белкам относят также ферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот (ДНК-полимеразы, ДНК-топоизомеразы, метилазы ДНК и РНК, РНК-полимеразы, РНКазы и ДНКазы и т.д.), белков хроматина (протеинкиназы, метилазы, ацетилазы, протеазы и др.) и многие другие.

Наиболее подробно изучены неистоновые белки т.н. группы с высокой подвижностью (HMG – high mobility group, или «белки Джонса»). Они хорошо экстрагируются в 0,35 М NaCI и 5% HCIO₄ и обладают высокой электрофоретической подвижностью (отсюда их название). Основных HMG-белков четыре: HMG-1 (м.в. = 25500), HMG-2 (м.в. = 26000), HMG-14 (м.в. = 100000. HMG-17 (м.в. = 9247). Эта группа наиболее богата представлена среди негистоновых белков: в клетке их около 5% от всего числа гистонов. Особенно часто эти белки встречаются в активном хроматине (примерно 1 молекула HMG-белка на 10 нуклеосом). Белки HMG-1 и HMG-2 не входят в состав нуклеосом, а связываются, видимо с линкерными участками ДНК. Белки HMG-14 и HMG-17 связываются с сердцевинными белками нуклеосом, что обеспечивает, вероятно, изменение уровня компактизации фибрилл ДНП, которые становятся более доступными для взаимодействия с РНК-полимеразой. В этом случае HMG-белки выступают в качестве регуляторов транскрипционной активности. Было обнаружено, что фракция хроматина, обладающая повышенной чувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMG-белками.

Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организации хроматина

Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов – нуклеосом и 30 нм фибрилл – еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 10⁴) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Таким образом следующие более высокие уровни компактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной или митотической хромосомы.

Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.

Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. «гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название «нуклеоида» (это только терминологическое сходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. «матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, они получили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) участков.

Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca⁺⁺ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н. хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.

Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ). В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическую композицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, что отдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру. Это – розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл, соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистых розеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина – хромомеры – можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных, растений, простейших (рис. 63).

Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальных препаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковилных структур (рис. 64).

Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65). При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.

Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК (рис. 66).

Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером средних репликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом – репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса.