Я.Мусил - Современная биохимия в схемах

III Ферменты

Ферменты - это биокатализаторы, образующиеся в клетке и представляющие собой либо простые белки, либо сложные, содержащие неаминокислотные компоненты.

Коферменты часто участвуют в переносе электронов или функциональных групп (водородный атом, ацетил, метил, аминогруппы и т.д.). Как и витамины, коферменты входят в качестве необходимого компонента в пищу и не могут синтезироваться в органах по крайней мере высших организмов.

Ферменты ускоряют биологические реакции, снижая энергию активации и не изменяя положения равновесия. Механизм их действия состоит в образовании комплекса ES между ферментом и субстратом, который вступает в химическую реакцию, после чего образовавшийся комплекс фермента с продуктом ЕР распадается до исходного фермента и продукта. Существование некоторых фермент-субстратных комплексов было доказано как косвенными (спектрофотометрия), так и прямыми методами (химическое выделение).

Субстрат связывается активным центром или участком фермента, который можно представить себе как пространственную организацию определенных аминокислот белковой части фермента с возможным участием простетической группы кофермента. Аминокислотами, часто играющими важную роль в активном центре, являются серин (ОН-группа) и гистидин (азот имидазольного кольца). Некоторые ферменты синтезируются непосредственно в активном виде, другие в виде неактивных проферментов (пепсиноген, трипсиноген) или имеют неактивную конформацию, в которой они существуют часть своей жизни (аллостерические ферменты). Для того чтобы начать функционировать, они должны быть активированы за счет специальных процессов.

Реакции, катализируемые ферментами, протекают с различными скоростями, зависящими от а) количества или активности фермента, б) концентрации субстрата, в) рН и состава раствора, г) температуры,

д) присутствия активаторов и ингибиторов.

а. Так как концентрацию ферментов в живой клетке трудно измерить, мы часто говорим об активности ферментов. Активность фермента измеряется в международных единицах (ME), соответствующих активности, превращающей 1 мкмоль субстрата в мин, или, как это было введено недавно, в каталах (кат), соответствующих активности, превращающей 1 моль субстрата в секунду. Удельная активность выделенного фермента выражается в единицах на 1 мг белка. Специфичность фермента определяется типами структур, которые могут превращаться под действием фермента. Если специфичность абсолютна, фермент может катализировать химическое превращение единственного соединения, если же она относительна, несколько близких соединений могут быть субстратами одного и того же фермента. Стереоспецифичность фермента указывает на то, что фермент связывает определенный стереоизомер (L- или D-форму). Следует отметить, что один и тот же субстрат может быть превращен несколькими теоретически возможными реакциями, катализируемыми различными ферментами. Это обстоятельство важно в некоторых процессах, контролирующих метаболизм.

б. При низких концентрациях субстрата ферментативная реакция протекает в соответствии с кинетикой реакций первого порядка, т.е. ее скорость пропорциональна концентрации субстрата. При высоких концентрациях субстрата реакция имеет нулевой порядок, т.е. фермент насыщен своим субстратом. Каждая ферментативная реакция характеризуется константой Михаэлиса Кm, она определяется как концентрация субстрата, при которой ферментативная реакция протекает со скоростью, равной половине от максимальной. Константа Михаэлиса не идентична константе диссоциации фермент-субстратного комплекса Кs, точно так же, как обратная величина не идентична константе ассоциации этого комплекса.

в.Для каждой ферментативной реакции существует оптимальное значение рН.

г.Каждая ферментативная реакция протекает наиболее быстро при определенной температуре.

д. Активаторы и ингибиторы ферментативной реакции - это соединения, ускоряющие и замедляющие ее соответственно.

31

ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЭНЗИМОЛОГИИ

Новая единица ферментативной активности была введена в 1973 г. и получила название катал (кат). Она соответствует количеству катализатора, способного превращать 1 моль субстрата в продукт за секунду. Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль субстрата • с-1 = 60 моль • мин =

=60•106 мкмоль•мин-1 = 6•107 ME.

1ME = 1 мкмоль • мин-1 = 1/60 мкмоль • с-1 = =1/60мккат = 16,67 нкат.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

В процессе ферментативной реакции образуется промежуточный фермент-субстратный комплекс. Субстрат связывается с ферментом в активном центре, который создается определенной пространственной конформацией полипептидной цепи (или

с активным центром в нескольких точках; образующийся таким образом комплекс обычно нестабилен и распадается с образованием продуктов и свободного фермента после протекания химической реакции.

Боковые цепи аминокислот, образующие активный центр, обычно способны к ионизации (кислоты), обладают нуклеофильными (электронодоноры) или электрофильными (электроноакцепторы) свойствами. Нуклеофильные группы могут быть связаны с ионами металлов (Mn2 + , Mg2 + , Zn2+), которые в некоторых случаях составляют неотъемлемую часть ферментов. Все эти группы участвуют в сорбции субстратов и превращении их в продукты.

ФЕРМЕНТЫ И КОФЕРМЕНТЫ

В некоторых ферментах в создании активного центра принимают участие молекулы кофермента, как это показано на рисунке на примере пиридоксальфосфата, входящего в состав активного центра фермента. Взаимодействие карбонильной группы пиридоксальфосфата с аминогруппой глутаминовой кислоты приводит к образованию основания Шиффа, содержащего альдиминную связь. Структура белковой части молекулы фермента способствует стабилизации определенных мезомерных структур основания Шиффа. В зависимости от при-

роды белковой молекулы связанная аминокислота может подвергаться переаминированию, декар-

боксилированию или изомеризации.

33

ГРУППЫ, ПЕРЕНОСИМЫЕ ФЕРМЕНТАМИ (КОФЕРМЕНТАМИ), И ПРИМЕРЫ КАТАЛИЗИРУЕМЫХ РЕАКЦИЙ

34

35

36

ВЛИЯНИЕ рН НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ

Большинство ферментов характерным образом изменяет свою активность в зависимости от рН. Оптимальной активности соответствует определенная область рН, причем уменьшение и увеличение рН приводит к снижению активности. Для различных реакций значения оптимума рН колеблются в широких пределах от сильно кислой среды (например, для пепсина) до сильно щелочной (например, для щелочной фосфатазы). Поэтому при работе с ферментами необходимо поддерживать рН с помощью соответствующего буфера.

Зависимость ферментативной активности от рН определяется значениями рК ионизующихся групп белковой молекулы, особенно тех, которые находятся в активном центре или вблизи него (и, возможно, играют роль в связывании кофермента), а также групп, ответственных за изменения состояния активного центра путем конформационных изменений белковой молекулы. Кроме того, рН может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата (в том числе, если субстрат является белком). Наиболее резко выражены отличия в оптимуме рН для ферментов пищеварительного тракта.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ

Температура всегда влияет на скорость реакции. В пределах физиологических условий скорость реакции растет с увеличением температуры (1), но выше определенной температуры начинается тепловая инактивация белковой молекулы (2). Эти два явления и объясняют появление температурного оптимума реакции.

Не все ферменты одинаково меняют свою активность с изменением температуры. Это свойство можно использовать для разделения некоторых специфических ферментов. В активность смеси ферментов, определенной при сравнительно низкой

температуре, вносят вклад все ферменты; при повышенной температуре активность смеси ферментов

определяется наиболее термостабильными ферментами.

АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Процесс активации идет одним из четырех путей:

1)отщепление олигопептида от профермента;

2)образование S—S-связей, делающее доступным активный центр;

3)образование комплекса с ионами металлов;

4)аллостерическая активация.

37

АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТА И ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА

Этот процесс удобно продемонстрировать на примере химотрипсина. При действии трипсина на полипептидную цепь химотрипсиногена, содержащего 245 аминокислотных остатков, последова-

тидные цепи, соединенные между собой пятью S—S-мостиками. Это меняет конформацию молекулы и формирует ее активный центр, в состав которого входят Ser195, His57, Asp102.

Белком, имеющим большое сходство в аминокислотной последовательности с химотрипсиногеном, является трипсиноген (239 аминокислотных остатков.) Его превращение в активный трипсин происходит при отщеплении гексапептида от N- конца молекулы. Конформация полипептидной цепи трипсина стабилизуется шестью S—S-связями.

АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

Они являются олигомерами, состоящими из двух или более мономеров. Аллостерические ферменты могут существовать в одном из двух обратимо связанных состояний - активном и неактивном. Каждый лиганд (субстрат, эффектор), спо-

собный образовывать комплекс с белком, может связываться с каждой белковой субъединицей - суб-

страт в активном центре, эффектор в регуляторном.

Связывание эффектора с одной субъединицей вызывает постепенное изменение конформации других субъединиц, приводящее в конечном счете к превращению аллостерического фермента в активное состояние. Обратный переход фермента из активного состояния в неактивное сопровождается изменением субстрат-связывающей активности.

Впроцессе превращения одной конформации

вдругую четвертичная структура белка остается неизменной.

Аллостерические ферменты принимают участие в контроле метаболизма в виде мулътиферментных систем. Влияние на метаболизм достигается за счет обратной, положительной или отрицательной связи.

Пояснения к схеме

1.Состояния аллостерического фермента зависят от его пространственной организации.

2.Аллостерическая активация достигается связыванием активатора (положительного эффектора).

3.Аллостерическая инактивация происходит

благодаря связыванию ингибитора (отрицательного эффектора).

38

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РАСЩЕПЛЕНИЕ АЦЕТИЛХОЛИНА ХОЛИНЭСТЕРАЗОЙ

Активный центр фермента состоит из двух функционально важных и пространственно разделенных мест:

1) связывающей области, куда входит СООгруппа, электростатически взаимодействующая с

положительно заряженным азотом N(+) субстрата;

2) каталитической области, ответственной за эстеразную активность фермента, в которую входят Ser, His, Tyr.

Ацетилхолин является субстратом, он связывается в активном центре определенным образом за счет образования ионной связи между отрицательно заряженной СОО- -группой и положительно

заряженным четвертичным атомом азота >N+< субстрата.

Впроцессе реакции протон гидроксилъной

группы тирозина активного центра связывается с атомом кислорода ацетилхолина (будущая спиртовая группа продукта реакции - холина). В результате увеличивается положительный заряд на углеродном атоме ацетильной группы субстрата, который атакуется отрицательно заряженным кислородным атомом белка, появившемся в результате диссоциации спиртовой группы серина активного центра. Связь между С (ацетила) и О (холина) разрывается с образованием в качестве промежуточного соединения ацетилсерина. Отшепляющийся от серина протон связывается кислородным атомом диссоциированной гидроксильной группы тирозина, и первоначальное состояние тирозина в активном центре восстанавливается. Гидролиз ацетилсерина начинается с диссоциации молекулы воды за счет взаимодействия протона с имидазольным кольцом гистидина активного центра. Освободившийся гидроксил атакует сложноэфирную связь ацетилсери-

с азотом имидазольной группы His, освобождается и вновь связывается с О- Ser. Так восстанавливается исходное состояние всех трех аминокислотных остатков активного центра. Образовавшиеся холин и уксусная кислота освобождаются из активного центра за счет диффузии.

Все описанные выше процессы протекают более или менее одновременно. Гидролиз ацетилхолина происходит благодаря согласованному действию всех функциональных групп активного центра.

Течение реакции определяется расстояниями между отдельными участками активного центра. Модельные опыты, проведенные с аналогами субстратов, показывают, что реакция протекает наиболее благоприятно, если основная группа гистидина находится на расстоянии 0,5 нм от СОО- и если тирозин расположен в 0,25 нм от боковой цепи серина. Это еще раз доказывает важность конформации активного центра для проявления активности.

39

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

При данной концентрации фермента скорость реакции зависит от концентрации субстрата. Графически зависимость скорости от концентрации субстрата описывается гиперболой, при низких концентрациях субстрата реакция имеет первый порядок, при высоких - нулевой.

Этот факт был использован Михаэлисом и Ментен для создания в 1913 г. фундаментальной теории ферментативной кинетики. В основе теории лежит предположение о том, что в процессе ферментативной реакции образуется фермент-суб- стратный комплекс, который подвергается химической реакции и разрушается затем до свободного фермента и продуктов реакции (уравнение 1). Характерная для каждой ферментативной реакции величина константы Михаэлиса Кm может быть определена следующим образом.

Концентрация свободного фермента после образования комплекса равна [Е] = [Еt] — [ES]. Общая скорость реакции зависит от скоростей образования и распада комплекса ES. Способность фермента образовывать комплекс с продуктами реакции обычно незначительна. В состоянии равновесия скорость v1 образования комплекса ES и скорость v2 его распада одинаковы (уравнение 2). Скорость образования продукта описывается уравнением v1 = k2[ES]; подставляя в это уравнение величину [ES] из уравнения 3, получаем уравнение 5.

Максимальная скорость реакции Vmax достигается при высокой концентрации субстрата, когда все молекулы фермента насыщены субстратом. Следовательно, [ES] = [Еt], и справедливо уравнение 6. Уравнение 5 может быть теперь переписано с использованием указанного выражения Vmax. Константа Кт может быть вычислена, если известны концентрация субстрата, скорость реакции и макси-

мальная скорость (уравнение 7). Если v = Vmax/2,

можно использовать уравнение 8, из которого видно, что Кт имеет размерность концентрации.

Величина Кт зависит от типа субстрата, рН реакционной смеси и температуры. Если фермент катализирует превращения нескольких близких субстратов, каждому субстрату будет соответствовать собственная величина Кт. В первом приближении реакция протекает тем быстрее, чем ниже Кт.

ЛИНЕАРИЗАЦИЯ УРАВНЕНИЯ МИХАЭЛИСА

Скорость реакции v выражается уравнением 9. После соответствующих преобразований оно превращается в уравнения 10, и затем 11, описывающее прямолинейную зависимость

у = а + bх,

где у = 1/v, а = 1/Vmax (отрезок, отсекаемый прямой

на оси ординат); b = Km/Vmax,(наклон прямой); х = 1/[S].

40