Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
"ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
им. Н.Н. БУРДЕНКО"
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
|
|
КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ ФИЗИКИ
Методические указания
студентам по теме лабораторного занятия
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ ВЕЩЕСТВА
Воронеж 2009
РАЗДЕЛ: Физика атомов и молекул. Элементы квантовой биофизики.
ТЕМА: Спектрофотометрический анализ вещества.
ЦЕЛЬ: Изучить законы поглощения света веществом; обозначить область применения фотоколориметрии в биологии, медицине, фармации; сформировать у студентов навыки проведения качественного анализа веществ с помощью фотоэлектроколориметра. После проведения лабораторного занятия студенты должен знать природу и основные характеристики оптического излучения, закономерности поглощения света веществом; иметь понятие об оптической плотности, светопропускании, светопоглощении.
ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ: В ходе выполнения работы студенты должны приобрести навыки практической работы с фотоэлектроколориметром, уметь проводить качественный анализ веществ, применять спектральные методы анализа веществ.
МОТИВАЦИЯ ТЕМЫ: Свойство атомов и молекул поглощать свет определенных длин волн, характерных для данного вещества, широко используется в медицине и фармации для проведения качественных и количественных исследований. Измерение спектров поглощения позволяет судить о химическом составе вещества и его состоянии в биологических структурах. Для регистрации спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области используют приборы спектрофотометры, только в видимой области – фотоэлектроколориметры.
I. Самостоятельная работа студентов во внеурочное время.
Задание 0.
Повторение материала школьного курса физики, раздел "Оптика", тема "Шкала электромагнитных волн".
Задание 1.
Изучить теоретический материал занятия, используя рекомендованную литературу и настоящую разработку, по следующей логической структуре учебного материала:
1. Природа света:
а) понятие о световой волне;
б) спектральные области оптического излучения.
2. Поглощение света веществом:
а) понятие о поглощении света веществом;
б) законы, описывающие взаимодействие света с веществом;
в) следствие из закона Бугера-Ламберта-Бера, описывающее связь между величиной оптической плотности и концентрацией вещества.
3. Характеристики поглощающей способности вещества:
а) оптическая плотность;
б) светопропускание;
в) светопоглощение;
г) связь между оптической плотностью и коэффициентом пропускания света;
д) понятие и физический смысл коэффициента молярной экстинкции (поглощения) вещества.
4. Спектр поглощения биологических веществ:
а) определение спектра поглощения вещества;
б) понятие о хромофорах;
в) хромофоры в биологических молекулах (белки, нуклеиновые кислоты).
5. Абсорбционная фотоэлектроколориметрия:
а) назначение, принцип действия, устройство фотометра КФК-3;
б) оптическая схема фотоэлектроколориметра;
в) применение абсорбционной фотоэлектроколориметрии в медицине и фармации.
Средства для самоподготовки студентов во внеурочное время
1. Учебная и методическая литература
а) основная
– Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М.: Дрофа, 2004. – С. 280-282, 446-450.
– Федорова В.Н. Медицинская и биологическая физика / В.Н. Федорова, Е.В. Фаустов. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – С. 302-310, 468-479.
– Антонов В.Ф. Физика и биофизика. Практикум /В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, Е.К. Козлова, А.В. Коржуев. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – С. 96-116.
– Блохина М.Е. Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической физике / М.Е. Блохина, И.А. Эссаулова, Г.В. Мансурова. – М.: Дрофа, 2002. – С. 237-246.
– Лекционный материал по разделу " Квантовая биофизика".
б) дополнительная
– Артюхов В.Г. Биофизика / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1994. – С. 229-234.
– Артюхов В.Г. Практикум по биофизике / В.Г. Арюхов и др. – Воронеж: ВГУ, 2001. – С. 51-57.
– Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева. – Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1996. – С. 61-171.
2. Консультации преподавателей (еженедельно по индивидуальному графику).
Теоретический материал по теме занятия
Свет или оптическое излучение представляет собой волны электромагнитного поля. Световые волны являются плоскопоперечными, они распространяются перпендикулярно направлению электрического и магнитного полей.
Различают следующие спектральные области оптического излучения: инфракрасная (ИК) – от 750 до 2500 нм, видимая – от 400 до 750 нм и ультрафиолетовая (УФ) – от 2 до 400 нм.
Известно, что при пропускании света через слой вещества его интенсивность уменьшается. Уменьшение интенсивности является следствием взаимодействия световой волны с электронами вещества, в результате которого часть световой энергии передается электронам. Это явление называется поглощением света.
Взаимодействие света с веществом описывается рядом законов, основными из которых являются:
1. Закон Гротгуса-Дрейпера: химически активным является излучение с такими длинами волн, которые поглощаются веществом. Этот закон не имеет исключений.
2. Закон Вант-Гоффа: количество химически модифицированного светом вещества прямо пропорционально количеству поглощенной веществом энергии света.
3. Закон Бугера-Ламберта-Бера (объединенный закон светопоглощения) для монохроматического света: интенсивность света, прошедшего через слой вещества (I), и интенсивность света, падающего на него (I0), связаны соотношением:
,
где – молярный коэффициент поглощения (экстинкции) при длине волны (л/моль∙см); с – концентрация вещества (моль/л); l – длина оптического пути – толщина слоя вещества (см).
Молярный коэффициент экстинкции характеризует способность молекул вещества поглощать свет определенной длины волны и определяется структурными особенностями молекул данного вещества.
Объединенный (основной) закон светопоглощения базируется на законе Бугера-Ламберта (первый закон светопоглощения), который определяет ослабление интенсивности светового потока в зависимости от толщины поглощающего слоя, и законе Бера (второй закон светопоглощения), описывающем зависимость светопоглощения от концентрации анализируемого раствора. Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется не всегда. Он выведен для достаточно разбавленных растворов при использовании монохроматического света.
Для характеристики поглощающей способности вещества используют такие величины, как оптическая плотность, светопропускание и светопоглощение.
Оптическая плотность (D) – это десятичный логарифм отношения интенсивности света, падающего на образец, к интенсивности света, выходящего из образца (I):
.
Оптическая плотность является безразмерной величиной.
Светопропускание (коэффициент пропускания) () – отношение интенсивности света, вышедшего из образца, к интенсивности света, падающего на него:
.
Значения могут меняться от 0 (весь свет поглощается) до 1 (весь свет проходит). Величину обычно выражают в процентах.
Иногда вместо используют светопоглощение (коэффициент поглощения) – величина, равная 1-
,
где Iп – интенсивность поглощенного света. Светопоглощение принято измерять в долях или в процентах.
Важнейшим следствием из закона Бугера-Ламберта-Бера является следующее положение: оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации данного вещества:
.
Спектр поглощения – это зависимость молярного коэффициента поглощения от длины волны . Спектры поглощения веществ определяются разностью энергий между энергетическими уровнями молекул, составляющими вещество, а также вероятностями перехода между ними. Разность энергий определяет длину волны, на которой происходит поглощение света, вероятность перехода – коэффициент поглощения вещества. Для биологически важных молекул характерны широкие полосы поглощения, обусловленные электронными, колебательными и вращательными уровнями.
Поглощение света осуществляется не всей молекулой, а определенными ее участками. Хромофоры – это отдельные группы атомов в молекуле вещества, поглощающие кванты света в УФ- и видимой областях спектра. В нуклеиновых кислотах хромофорами являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил), поглощающие в УФ-области (180-220 и 240-280 нм).
Белки имеют три типа хромофорных групп: собственно пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и простетические группы. Первые два типа хромофоров поглощают только в УФ-области. Пептидные группы –CO-NH– поглощают в области 190 нм. Боковые группы трех ароматических аминокислот – триптофана, тирозина и фенилаланина – также поглощают на этих длинах волн, причем значительно сильнее, чем пептидные группы. Кроме того, они имеют полосу поглощения в диапазоне 260-280 нм.
|
|
|
Рис. 1. Спектры поглощения гемоглобина, связавшего кислород – оксигемоглобин (сплошная линия) и свободного гемоглобина – дезоксигемоглобин (пунктирная линия) |
Спектры поглощения можно регистрировать различными приборами. В видимом диапазоне (380-760 нм) спектр поглощения определяет цвет вещества, поэтому прибор для измерения спектров называется колориметром (от лат. сolor – цвет). Современные колориметры позволяют проводить измерения в более широком спектральном диапазоне от ультрафиолета до ближнего инфракрасного (315–980 нм).
Применение фотоэлектроколориметрии в биологии, медицине и фармации:
1. Измерение концентрации окрашенных веществ (некоторых витаминов, лекарств) в растворе.
2. Определение рН среды по цвету добавленных в раствор рН–индикаторов.
3. Определение активности ферментов по интенсивности окрашивания раствора после добавления соответствующих химических реагентов, дающих окрашенные реакции с продуктами ферментативной реакции (например, оценка активности АТФ-аз по скорости образования неорганического фосфата).
4. Оценка скорости роста микроорганизмов по увеличению оптической плотности культуральной жидкости вследствие рассеяния света на микроорганизмах.