Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии

которые могли бы внести ясность в энергетику и механизм явления, однако, не проводится.

2. Вместе с тем, представлялось возможным, что изучение аутокатализа тирозина может быть доступно, наряду с митогенетическим методом, и другим методом исследования.

Начнем с спектрального анализа переносов тирозина (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959). Предварительное изучение водных растворов тирозина показало, что пороговой концентрацией, при которой еще ясно обнаруживается типичный для него спектр, является приблизительно 10-9 по весу. Тирозин в растворе гликокола еще обнаруживается спектральным методом при разведениях в 1012—1014 раз. Приведем результаты опыта, в котором исследовался перенос тирозина с разведением в 1012 раз (табл. 4).

Утверждение, что самовоспроизведение тирозина (оксифенильной группы) идет за счет гликокола, позволяет сделать некоторые, доступные экспериментальной проверке, выводы. Является вполне правдоподобным, что молекула тирозина строится за счет восьми молекул гликокола (по числу СН2 групп), кроме того, при этом используются одна аминогруппа, одна карбоксильная группа и одиннадцать атомов водорода. Таким образом, наряду с построением молекулы тирозина, могут идти еще другие реакции, т. е. дополнительные рекомбинации неиспользованных свободных радикалов и атомов. Можно ожидать, что по крайней мере некоторые из возникших таким путем соединений могут быть обнаружены. Примерный энергетический расчет показывает,

40

что общий баланс при допущении таких побочных рекомбинаций резко положителен, т. е. затрата энергии на расщепление восьми молекул гликокола покрывается с избытком приблизительно в 100 ккал/моль образованием молекулы тирозина и следующих возможных молекул: муравьиной кислоты, формальдегида, гидразина, гидроксиламина, аммиака, окиси углерода.

Таким образом, легко представить условия, при которых процесс аутокатализа тирозина является термодинамически выгодным. Методом спектрального анализа удалось действительно обнаружить в высоких переносах, наряду с оксифенильной группой, и полосы, характерные для гидроксиламина и формальдегида.

В случае тирозина, так же как и при аутокатализе ферментоидов, первые фазы процесса представляют собой активную реакцию между затравкой и субстратом, которая должна быть связана с возникновением излучения. При проведении экспериментов выяснилась следующая интересная закономерность: внесение в гликокол циклических соединений (пиридин, пролин, триптофан, индол, тимин, глицил-ангидрид, пиррол, тирозин, аденин) сопровождается вспышкой излучения, в то время как при внесении соединений с открытой цепью излучения не возникает (аргинин, креатин, глютамингидрохлорид, глицил-глицин).

Применение метода переносов к аденину, пирролу и индолу показало их способность к аутокатализу в растворе гликокола. Остальные соединения пока не исследованы.

Описанные факты, с нашей точки зрения, убедительно показывают возможность самовоспроизведения простых циклических органических соединений за счет гликокола. Энергия активации, обуславливающая возникновение первых фаз процесса (возникновение свободных радикалов и их рекомбинаций), приводящих к возникновению митогенетического излучения, дается, по-види- мому, длинноволновым ультрафиолетом, присутствующим в дневном свете и поглощаемым циклическими соединениями. Это следует из того, что внесение циклических соединений в гликокол в полной темноте не приводит к возникновению вспышки митогенетического излучения.

41

Исследованные циклические соединения соответствуют тем требованиям, которые, судя по литературным данным, предъявляются к молекулам-матрицам: они плоски и доступны с обоих сторон к подходу для элементов субстрата.

Дальнейшая работа развивалась в различных методических направлениях и показала возможность приме-

Спектры поглощения в ультрафиолетовой области.

Раствор тирозина в разведении 10-5 прибавлялся к растворам гликокола различных концентраций (А. Г. Гурвич, А. А. Гурвич, 1959). Молярное соотношение тирозина к гликоколу выражалось при этом в следующих цифрах:

0,025% гликокола . . . 1:60

Параллельно делались идентичные растворы тирозина в воде. Поглощение тех и других растворов фотографировалось в толстом слое (15 см). Стабилизированный источник излучения обладал непрерывным эмиссионным спектром. Измерение поглощения производилось фотометрическим путем, при этом из величины, характеризующей поглощение тирозина в гликоколе, вычиталась величина поглощения гликокола (снималась в том же опыте, на той же пластинке) и из поглощения тирозина в воде вычиталось поглощение воды. Экспозиции производились через 30—40 мин после присоединения тирозина к гликоколу и соответственно к воде. Кривые характеризующие результаты и являющиеся средними из большого числа опытов, показывают, что поглощение тирозина в характерной для него области (2700— 2800 А) проявляется яснее всего в 2% растворе гликокола. При этом увеличение поглощения по сравнению с поглощением тирозина в воде или в наиболее слабом растворе гликокола достигало 50—80% (рис. 9).

Метод бумажной хроматографии. Большое число опытов было проведено на нисходящих хроматограммах. Растворителем служил воднонасыщенный раствор бутанола, проявителем — нингидрин. Молярное соот-

42

ношение тирозин-гликокол (1%) лежало в границах 1 : 300—1 : 500. Смесь тирозина и глнкокола приготовлялась за 30—40 мин до нанесения на хроматограмму.

Контролями служили соответственные водные растворы тирозина. На бумагу повторно, с промежуточными высушиваниями, наносились небольшие объемы

Рис. 9. Кривые поглощения тирозина при его самовоспроизведении в растворах гликокола (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959).

Нарастание поглощения при увеличении концентраций гликокола. Контрольная кривая дана пунктиром.

По оси ординат — коэффициент поглощения.

смеси с таким расчетом, чтобы контрольное пятно содержало 12—15 у тирозина. В большинстве опытов для полной сравнимости диффузии аминокислот на бумаге на высохшее пятно тирозина наносилось соответствующее количество гликокола.

Рис. 10 иллюстрирует один из большого количества опытов. Здесь ясно видно увеличение пятна тирозина отдиффундировавшего из опытной смеси. В преобладающем числе опытов были получены положительные результаты с различной степенью яркости.

Адсорбция тирозина на угольной колонке и последующая его элюация. Результаты, полученные этим

43

методом, кажутся нам наиболее убедительными, так как они позволяли количественные промеры прироста тирозина по сравнению с исходным. Сравнивались три порции с равными количествами тирозина (8 мг), одна из которых содержала, кроме того, гликокол (2,5% рас-

Слева (внизу) —после самовоспроизведения в рас-

как раствор тирозина высох)

твор), две других соответственные объемы воды. Мо-

угольные колонки, тирозин элюировался, и после соот-

44

пропущенный через колонку водный раствор тирозина считался 100%, с ним сравнивались второй водный контроль и опытная порция Приведенные цифры в контрольной колонке таблицы (табл. 5) (все ниже 100%) показывают на неизбежные потери некоторого количества тирозина, в большинстве опытов, наоборот, получился прирост, который можно рассматривать только как результат увеличения количества тирозина после его пребывания в гликоколе. Таким образом, средняя разница достигает почти 15%, т. е. является совершенно достоверной величиной.

Применение меченого гликокола. Результаты, полученные этим методом, нельзя рассматривать как законченные, но они позволяют думать, что и этим методом аутокатализ тирозина в гликоколе может быть показан с полной отчетливостью. Употреблялся гликокол с меченым углеродом (С14) в карбоксильной группе. Радиоактивный гликокол смешивался с обычным в отношении 1 : 10. Молярные соотношения тирозина к гликоколу

45

и радиоактивного гликокола (без тирозина). Для возможно более полного отделения тирозина от гликокола, что в данном случае было особенно важно, производилось повторное хроматографирование и опыта, и контроля. Для этого участки бумаги первых хроматограмм, соответствующие тирозиновому уровню, вырезались, тщательно отмывались в горячей воде, отмывы концентрировались и наносились на вторую бумажную ленту.

Рис. 11. Самовоспроизведение тирозина в меченом гликоколе (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1959).

а —без гидролиза; б —после гидролиза.

По оси ординат — концентрация в условных единицах (сплошная линия — опытная смесь, пунктирная — контрольная смесь).

О — гликокол; P — предполагаемый пептид; Г —тирозин (на абсциссе длина бумажной ленты в см).

Радиоактивность готовых хроматограмм измерялась на счетчиках излучения по всей длине лент. После этого хроматограммы проявлялись и сопоставлялись результаты счета и красочной реакции.

Данные четырех опытов показали следующую картину: высокий пик активности соответствует остаточному гликоколу. Чему соответствует значительно более низкий, близкий к гликоколу пик, не представляется пока ясным; возможно, что он соответствует пептидам, синтез которых шел параллельно с аутокатализом тирозина, третий пик активности, тоже низкой интенсивности, соответствует по своему положению тирозину, В двух следующих опытах был проведен гидролиз отмыва от первой хроматограммы. На окончательной хро-

46

Анализ митогенетических эффектов ГЛАВА 2. в живых системах

Вполне естественно было ожидать, что митогенетические явления в организованных (живых) системах более сложны и труднее поддаются анализу, чем в растворах. Уже в первые годы исследований встали два основных вопроса: 1) можно ли с полной уверенностью утверждать, что регистрируемое излучение непосредственно, или во всяком случае косвенным путем, отражает именно внутриклеточные процессы или внутриклеточное состояние субстрата? 2) Чем объяснить раз-

состояний, а в некоторых системах сводящуюся к постоянному отсутствию изучения?

Обоснованность первого вопроса очевидна. Несомненно, целый ряд объектов омывается тканевыми жидкостями, поглощающими ультрафиолетовое излучение, наряду с этим, многие имеют оболочки различной толщины и характера, тоже, конечно, поглощающие ультрафиолет (особенно это относится к мякотным оболочкам нервных волокон).

Вместе с тем, однозначность связи между функциональными состояниями систем и спектрами митогенетического излучения твердо установлена. Мы имеем при этом главным образом в виду многочисленные и разнообразные наблюдения над зависимостью эмиссионных спектров мозговой коры и периферической нервной системы от их функционального состояния. Не менее убе дительны факты, о которых мы будем еще подробно говорить: спектры излучения печени, возникающего при определенных условиях, необычайно тонко и быстро реагируют на введение под кожу ничтожных количеств некоторых веществ, излучение растительных клеток возникает в ряде случаев только при движении протоплазмы.

Все эти результаты совершенно однозначно показывают, что улавливается излучение, специфическое для процессов в глубинных слоях клеток. Наиболее есте-

48

ственно и вероятно представление о том, что излучение внутреннего субстрата, поглощаясь поверхностными слоями, вызывает в них вторичное излучение, улавливаемое внешними детекторами. При этом встает вопрос о соответствии спектрального состава первичного и вторичного излучения.

Предположение о некоторых сдвигах и изменениях спектрального состава является вероятным. Но, вместе с тем, мы располагаем экспериментальными данными, полученными на вырезанной твердой мозговой оболочке кролика и на вырезанной брыжжейке лягушки, показывающими не только ясное возникновение вторичного излучения, но и соблюдение резонансности, т. е. воспроизведения в спектре вторичного излучения оболочек тех полос, которыми они первично облучаются.

Перейдем к вопросу о постоянном отсутствии излучения некоторых органов (печень, почка) и временной потери способности к излучению клеткой (например, при остановке течения протоплазмы в растительной клетке). Один из наиболее интересных и важных вопросов о временной потере излучения клеткой в средние фазы интеркинеза и возникновении вспышки излучения перед митозом мы рассмотрим более подробно в главе, посвященной клеточному делению.

Наиболее вероятное представление, опирающееся на модельные данные, заключается в следующем. Для возникновения фотонов ультрафиолетового уровня необходимо сочетание условий, осуществляющееся не так часто: во-первых, достаточно высокое возбуждение молекул, которое может быть достигнуто поглощением энергии высокотеплотных актов (рекомбинаций свободных радикалов) или суммацией небольших квантов энергии, в том случае, если субстрат представляет собой адекватную для этого, т. е. упорядоченную молекулярную систему. Во-вторых, способность субстрата высветить хотя бы часть энергии молекулярного возбуждения. Выше уже говорилось о том, что даже при наличии достаточных по теплотности квантов энергии высвечивание этой энергии может осуществляться только при соответствующей дисперсии субстрата. Ряд модельных опытов показывает, что высокомолекулярные тела-белки, нуклеиновые кислоты, гликоген не являются хемофлуоресцентами, т. е. не способны высвечивать поглощенную