Проблема митогенетического излучения как аспект молекулярной биологии

ферментативная система — уреза + мочевина. Спектры излучения обеих систем предварительно тщательно изучались. Прибавление к той и другой системе небольших концентраций глюкозы меняло спектральную картину — наряду с типичными для обеих систем полосами, возникали и полосы, характерные для глюкозы1 (рис. 1) (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1939). Излучение, или флуоресценция, вещества за счет поглощения им

Рис. 1. Примеры спектров сенсибилизированной флуоресценции, полоса 2290—2300 Å (заштрихованная) характеризует излучение гли- [кокола (А. Г. Гурвич, Л. Д. Гурвич, 1945).

1 — облученный гликокол +радикал PO4 (раствор ортофосфорной кислоты); 2 — излучение при ферментативном расщеплении нуклеиновой кислоты или лецитина; 3—облу- ченный гликокол+ фосфорнокислый натрий; 4 — облученный гликокол + хлористый натрий.

энергии, выделяющейся при химической реакции, было обозначено по предложению физика А. Н. Филиппова как «сенсибилизированная» флуоресценция. По своему существу оно равнозначно понятию хемилюминесценции.

Описанные данные являются лишь частью более широких исследований, показавших, что именно этот механизм передачи энергии является общим принципом возникновения митогенетического излучения.

10

Исследования E. А. Гордон (1940) показали хорошее совпадение спектра бензола, изученного физическим методом (Pringsheim), со спектром сенсибилизированной флуоресценции, возникающим при прибавлении бензола к ферментативной системе (рис. 2). Таким образом, было обнаружено сходство между флуоресценцией, наблюдаемой митогенетическим методом, и флуоресценцией в обычном физическом смысле слова.

рении в нем предварительно облученного гликокола.

Основные митогенетические данные могли быть поэтому рассмотрены с этой же точки зрения.

Исследование различных химических соединений показало, что далеко не все вещества являются флуоресцентами. В частности, представляющие особенный

оресцируют как целые молекулы. Их элементы, особенно ясно это показано для нуклеиновой кислоты, обладают, однако, способностью к сенсибилизированной флуоресценции. При прибавлении фермента фосфатазы (кашица печени) к раствору дезоксирибонуклеиновой кислоты от крупного органического ядра отщепляется входящий с ним в эфирную связь радикал фосфорной кислоты — PO4. При этом возникает излучение, характеризующееся определенным спектром. Идентичный спектр получается и при ферментативном расщеплении лецитина, также заключающего радикал фосфата в эфирной связи. Одно это уже показывает, что излучение как-то связано с свободным радикалом фосфата,

11

т. е. что флуоресцентом является именно он. Действительно, при прибавлении к излучающему гликоколу следов фосфорно-кислого натрия в спектре возникают полосы, наблюдающиеся при действии фосфатазы и, наряду с этим, ряд новых полос, которые предположительно можно связать с ионом натрия.

Это предположение подтвердилось, когда к излучающему гликоколу вместо фосфорнокислого натрия прибавляли некоторое количество хлористого натрия. В возникающем при этом спектре излучения обнаруживались все те полосы, которые приписывались иону натрия (см. рис. 1).

отражения в спектре сенсибилизированной флуоресценции. Вместе с тем, способностью к флуоресценции обладают простые ионы и радикалы. Кроме того, совпадение спектра излучения глюкозы, наблюдаемого при ее прибавлении к чуждой ей ферментативной системе, со спектром, возникающим в системе глюкоза — зимаза, показывает, что и во втором случае флуоресцируют именно не затронутые ферментативным расщеплением молекулы глюкозы.

Другими словами, для различных, не высокомолекулярных, химических соединений (элементов) вероятность возникновения излучения под влиянием поглощенной ими химической энергии велика. Закономерностью общего характера является то, что высокомолекулярные соединения как целое не флуоресцируют.

Наряду с этим в составе пептидов обнаружено наличие так называемой флуорофорной группы. Пептидная связь — функциональная группа, соединяющая два

соседних пептида , обладает способностью к высвечиванию поглощенной ею химической энергии. На это указывает совпадение спектров сенсибилизированной флуоресценции двух различных дипептидов: глицил-глицина, состоящего из двух остатков гликокола, и глицил-тирозина, состоящего из остатков гликокола и тирозина. Общей для этих веществ является только пептидная связь (гликокол, входящий в состав обоих пептидов, не флуоресцирует). При ферментативном расщеплении этих дипептидов возникают

12

полосы, характерные для пептидной связи. И в этом случае флуоресцируют элементы (в данном случае отдельные входящие в молекулы функциональные группы, а не молекулы целиком), не расщепляющиеся непосредственно ферментами.

Описанные факты достаточно обосновывают право рассматривать излучение, возникающее при ферментативных процессах, как флуоресценцию тех или иных присутствующих в растворах веществ независимо от того, участвуют ли они в данной реакции или нет. Сами же радикалы, рекомбинация которых дает необходимую энергию, остаются при этом как бы в тени, за исключением радикала гидроксила, полоса которого обнаруживается во многих случаях ферментативного расщепления. Описание методов обнаружения радикалов является задачей настоящей главы. Расчет энергетического баланса будет производиться с учетом участия в реакции видимого света и атмосферного кислорода.

Первый этап состоял в определении спектров-этало- нов трех радикалов, наиболее существенных для анализа ферментативных реакций: гидроксила, свободной карбонильной группы и свободной аминоили иминогруппы. Определение было основано на том, что при фотодиссоциации данного тела возникают следующие возможности:

1) энергия фотона облучения достаточно велика для расщепления данного соединения и для возбуждения одного из возникающих при этом радикалов, 2) энергии фотона не хватает для этих двух актов, т. е. радикалы освобождаются в невозбужденном состоянии. Но можно предположить, что при достаточно интенсивном облучении свободный радикал поглотит второй фотон, которым и будет возбужден.

Из интересующих нас радикалов только гидроксил удовлетворяет первому условию. Если исходить из перекиси водорода, на диссоциацию которой на два гидроксила нужно затратить приблизительно 52 ккал/моль, и из энергии возбуждения гидроксила, равной приблизительно 93 ккал/моль, то при подсвечивании полосой ультрафиолетового, даже очень слабого излучения в области 1900 А, соответствующей 150 ккал/моль, поглощение одного фотона может сразу привести к появлению возбужденного радикала гидроксила. Действительно,

13

облучение перекиси водорода излучением ферментативных процессов, субстраты которых содержат глюкозу или мочевину (вещества, в спектры флуоресценции которых входит полоса 1900 Å), приводит к возникновению возбужденного гидроксила, — возникает полоса его флуоресценции 3060 Å.

В противоположность этому возникновение свободной карбонильной группы в возбужденном состоянии, которая может быть получена при диссоциации ацетона, возможно только при облучении ацетона более интенсивным ультрафиолетовым источником. Это объяс-

бодной карбонильной группы необходимо практически одновременное поглощение второго, тоже высокоэнергетического, фотона. Полоса излучения возбужденной карбонильной группы лежит в области 2020—2040Å.

Таким же методом обнаруживается эмиссионный спектр свободной аминогруппы. Он возникает при подсвечивании водного раствора аммиака достаточно интенсивным ультрафиолетовым облучением коротковолновой области с энергией фотонов порядка 150 ккал/моль или при одновременном подсвечивании двумя полосами: одной, лежащей у границы сплошного поглощения аммиака (2260 Å), и второй, соответствующей полосе испускания аминогруппы (2530 Å). Таким образом, и в этом случае речь идет о двухактном процессе, т. е. сначала об отщеплении аминогруппы, а затем о ее возбуждении.

Таким образом, спектры-эталоны трех наиболее важных для ферментативных реакций радикалов давали возможность изучения светящихся фаз реакций.

Приведем пример одного из опытов с системой глюкоза + зимаза (из дрожжевой вытяжки). Спектр излучения данной реакции, включающий в основном полосы, характерные для глюкозы, состоит из 4 полос: 1900—

1920Å, 1940—1950 Å, 1960—1970 Å, 2160—2170Å и, кроме того, из полосы 3060—3070 Å, типичной для свободного радикала гидроксила.

Раствор глюкозы (5%) подсвечивается полосой 2030—2040 Å от значительно ослабленного излучения водородной лампы. При этом констатируется отсутствие излучения раствора. Затем к такому же раствору глю-

14

козы прибавляется фермент (в отношении 1 : 100) и повторяется подсвечивание. В растворе возникает излучение, содержащее спектральную полосу 2030—2040 Å. Наконец, фермент прибавляется в таком же отношении к воде, при подсвечивании этой системы излучение не возникает. Ниже приводится излучение полосы 2030— 2040 Å при подсвечивании растворов той же полосой:

%

нии, возникала также полоса 2530 Å, характерная для аминогруппы (или иминогруппы).

Наличие свободных радикалов при протекании ферментативных реакций было показано, таким образом, с достаточной достоверностью. Объяснение этих фактов не встречает затруднений с энергетической точки зрения, если принять во внимание участие в реакциях видимого света и атмосферного кислорода. Исследованные ферментативные реакции ведут себя в этом отношении, однако, неодинаково. Система глюкоза + зимаза сохраняет способность к излучению при наличии кислорода и в полной темноте, в то время как для из-

При расчете энергетического баланса делаются следующие допущения. Молекула фермента действует на молекулу субстрата совместно с двумя фотонами видимого света, величину которых можно определить установлением длинноволновой границы активно действующей области. В эту реакцию вовлекаются атмосферный кислород и вода.

Наиболее простая схема расчета, особенно если принять во внимание, что отдельные этапы ферментативных процессов не являются еще в некоторых случаях до конца расшифрованными, состоит в следующем: составляется общий расходный баланс из расчета, что молекулы субстрата, О2 и Н2О разлагаются на атомы или сравнительно простые радикалы (О, ОН, NH2, CO). Вычисляется энергия, освобождающаяся при

15

соединении радикалов в химически регистрируемые продукты реакции. Наряду с этим, учитывается энергия, возникающая и при предположительных рекомбинациях радикалов в другие соединения, не обнаруживаемых химическим анализом вследствие редкости их возникновений, т. е. ничтожности концентраций возникших соединений. Энергия рекомбинаций некоторых радикалов, которая, судя по спектру митогенетического излучения реакции, является как раз необходимой для этой эмиссии, при этом не учитывается. Получаемый таким образом дефицит (при вычитании из общего расходного баланса общего приходного баланса) покрывается (расчетным образом) энергией двух фотонов видимого света.

Такая схема расчета приводит к выводам, доступным экспериментальной проверке.

Приведем в качестве примера наиболее простой случай— расщепление мочевины ферментом уреазой. Продуктами гидролиза являются NH3 и СО2, реакция слабо экзотермическая, порядка 2 ккал/моль. Спектр излучения доходит при этой реакции до 1940 Å в коротковолновую сторону. Необходимо поэтому предположить появление, по крайней мере, двух видов свободных радикалов, рекомбинация которых может дать соответственную энергию. В данном случае речь может идти о свободном карбониле и об атомарном кисло-

роде, рекомбинация которых дает энергию порядка

167 ккал/моль.

При расщеплении мочевины, воды и молекулярного кислорода затрачивается следующая энергия:

16

При этом неиспользованными остаются радикалы

Дефицит, равный 118 ккал/моль, предположительно покрывается двумя фотонами видимого света, около 60 ккал каждый, соответствующих примерно 4700А, т. е. зелено-голубому участку спектра. Эти расчеты можно подтвердить экспериментально двумя путями:

в которой производилось подсвечивание ферментатив-

Разберем аналогичным образом реакцию расщепления дипептида глицил-глицина эрепсином.

Предположим, что произошел разрыв связей, обозначенных буквами а—е. Энергия диссоциации выражается следующими величинами:

а —60 ккал/моль; в —60; с —93; d — 93; в — 71.

Кроме того,

Н2О —> Н + ОН —110 ккал!моль О2 — • О + О — 118 »

Общая сумма затраты энергии 605 ккал/моль

Предположительные рекомбинации:

1) Присоединение —Н к —NH правой половины расщепленного дипептида, т. е. восстановление молекулы гликокола + 87 ккал/моль;

2)свертывание двух валентностей свободного

4- 120 ккал/моль;

меньше 60 ккал/моль, соответствующими 4600 А (синезеленая область). При этом остаются свободные радикалы NH2, СО, ОН, О. Как видно из приводимых результатов, совпадение между рассчитанной и обнаруженной эффективностью видимого света не является таким близким, как в предыдущей группе. Разница приблизительно в 10 ккал/моль может быть объяснена неточностью определения энергии некоторых связей.

При подсвечивании системы белок + желудочный сок различными спектральными областями были получены следующие величины эффекта излучения:

На этой же системе была показана так называемая квадратическая зависимость интенсивности митогенетического излучения системы от интенсивности подсвечивания, указывающая на то, что речь идет именно об утилизации энергии двух, почти одновременно попадающих фотонов видимого света. Для этого ферментативный процесс подвергался освещению зеленым светом определенной интенсивности I, затем интенсивность уменьшалась в 1,5 раза. Необходимая для обнаружения митогенетического излучения длительность экспозиции возрастала в (1,5)2 раза (табл. 1).

Действительно, пороговая экспозиция для обнаружения излучения системы при полной интенсивности подсвечивания равна 4—5 мин, при подсвечивании, ослабленном в 1.52 раза,— 10—12 мин, т. е. отношение интенсивностей излучения, обратно пропорциональное экспозициям, равно приблизительно 2,5 или иначе 1,52.

Несомненно, что работу в этом направлении, т. е. проведение расчетов с последующей экспериментальной

18