Изучение кариотипа животных (80

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ

Кафедра генетики, разведения и биотехнологии животных

ИЗУЧЕНИЕ КАРИОТИПА ЖИВОТНЫХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

по дисциплине «Генетика и биометрия»

Направление: 111100 – «Зоотехния»

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2011

Методические указания разработаны и подготовлены: кандидатом биологических наук, доцентом В.И. Митютько, ассистентом А. Ю.Алексеевой.

Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании методической комиссии зооинженерного факультета «18» марта 2011 г. (протокол №6) и утверждены на Методическом совете университета «___»___________2011 г.

Введение

Раздел генетики, посвященный изучению и описанию материальных структур наследственности на клеточно-ядерном уровне, получил название цитогенетики. Структуры клетки изучают с помощью световой, электронной, фазовоэлектронной микроскопии, рентгеноскопии и других физических методов. Дополнительно для изучения поведения и функционирования хромосом и механизмов их воспроизведения при клеточном делении применяются цитохимичские, биохимические, биофизические, физиологические и другие методы. Исследование строения и поведения хромосом в сочетании с результатами гибридолгического анализа дает возможность получить еще большую информацию о наследственности.

Цитогенетические методы позволяют:

1.Выявить числовые и структурные аномалии хромосом.

2.Установить филогенетические связи между группами животных, растений (видами, родами, семействами и т.д.).

3.Уточнить эволюцию кариотипа.

4.Дополнить генетичекий анализ при установлении групп сцепления.

5.Осуществить генетический мониторинг в процессе селекции.

6.Дать цитогенетическую оценку производителям и самкамдонорам при искусственном осеменении и трансплантации эмбрионов.

7.Установить пол и хромосомные аномалии эмбрионов.

1

8.Установить фримартинизм у двоен (по химеризму половых хромосом).

9.Проводить генетическиймониторгинг при выполнении программ по сохранению генофонда пород, сортов и линий.

10.Осуществлять контроль при проведении работ по клонированию животных, растений, при культивировании клеток (пересадка ядер, гибридизация соматических клеток, перенос генов, хромосом).

11.Выявлять хромосомные нарушения, которые могут быть использованы в качестве теста на повреждающее действие мутагенов.

2

Строение хромосом. Кариотип

Набор хромосом соматической клетки, типичный для данного вида организмов, называется кариотипом. В соматических клетках число хромосом в 2 раза больше, чем в половых. Это связано с тем, что половина хромосом (геном) переходит потомку от матери и половина от отца. Одинаковые по форме и размерам хромосомы (по одной от родителей) называют гомологичной парой. Двойной набор хромосом называют диплоидным. В половых клетках набор хромосом одинарный, и его называют гаплоидным или геномом.

Хромосомы каждого вида животных, растений имеют свои морфологические особенности. Морфологию хромосом обычно описывают и изучают на стадии метафазы, когда они лучше всего видны в клетке и находятся в экваториальной плоскости.

Хромосома состоит из двух нитей – двух хроматид.

Рис. 1. Типы хромосом

Типы хромосом определяются положением первичной перетяжки или центромеры. Она различима в виде более светлой зоны.

Хромосомы чаще всего имеют одну центромеру, к ней прикрепляются

3

нити веретена деления. Потеря центромеры приводит к нарушению подвижности хромосомы и ее потере.

Известны виды, содержащие полицентрические хромосомы с так называемой диффузной центромерой (ожика, аскарида).

Центромера делит хромосому на два плеча.В зависимости от расположения центромеры различают:

а) метацентрические хромосомы, у которых центромера расположена посередине или почти посередине;

б) субметацентрические с плечами разной длины; в) акроцентрические хромосомы, у которых центромера

находится на конце и второе плечо очень мало; г) телоцентрические хромосомы, у которых короткое плечо не

различают на цитологических препаратах.

Хромосомы могут иметь вторичные перетяжки, которые могут быть связаны с образование ядрышек, поэтому их называют ядрышковыми организаторами. В них локализованы гены, ответственные за синтез рРНК.

Теломеры иликонцевые участки хромосом в значительной степени ответственны за существование хромосом как индивидуальных образований. Именно теломеры препятствуют слипанию хромосом.

У некоторых хромосом есть спутники – участки, соединенные с остальной частью хромосомы тонкой нитью хроматина. Форма и величина спутника постоянны для хромосом, которые их имеют.

В структуре хромосом, видимых в световой микроскоп, различают более темные участки – гетерохроматин и более светлыеэухроматин. В гетерохроматине хромосомы сильнее спирализованы,

4

функционально менее активны, чем в эухроматине, где локализована большая часть генов.

Гетерохроматин концентрируется у центромер, у теломер, участвует в регуляции транскрипции генов. Эти участки изменчивы по обилию и составу даже у близких видов. Характер распределения этих участков постоянен для каждой хромосомы, что служит дополнительным критерием при их идентификации на цитологических препаратах.

Рис.2. Кариограмма человека. Дифференциация по длине хромосом при окрашивании.

Дифференцировка хромосомы по длине может быть выявлена искусственным путем с применением дифференциальной окраски, которая основана на применении красителей, специфически связывающихся с участками ДНК определенного строения. Метод эффективен для выделения гомологичных хромосом. Процедура

5

окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфического для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности.

В совокупность признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор (кариотип) входит: число хромосом, их форма, определенная расположением центромеры, наличие вторичных перетяжек, спутников, эу- и гетерохроматиновых участков и т. д. Таким образом, кариотип – это паспорт вида. Кариотип может быть изображен в виде идиограммы (кариограммы) – схемы, на которой хромосомы располагают в ряд по мере убывания их длины. Каждой паре хромосомы присваивают номер. Половые хромосомы (ХХ или XY) выделяют отдельно.

Рис.3. Кариограмма G окрашенных хромосом свиньи: р – короткое плечо; q – длинное плечо.

6

Рис.4.Кариотип и метафазная пластинка хряка.

Рис. 5. Метафазная пластинка крупного рогатого скота.

Методика приготовления цитологических препаратов для изучения кариотипа животных

Одним из наиболее доступных методов изучения хромосом у птиц и млекопитающих является метод культуры лейкоцитов.

Существует несколько модификаций этого метода у разных видов животных и человека. Общим является то,что как правило, используют венозную кровь, которую в стерильных условиях разделяют на фракции, используя фракцию крови со взвешенными в

7

ней лейкоцитами. Разливают суспензию в пенициллиновые флаконы, добавляют питательную среду. Для стимуляции митоза вводят фитогемагглютинин (ФГА), который получают из семян фасоли. Флаконы помещают в термостат с температурой 37-38˚ и выдерживают 24-72 часа. За несколько часов до конца инкубации добавляют колхицин, разрушающий веретено деления. В результате митоз задерживается на стадии метафазы. Это позволяет получить на одном препарате много клеток с отчетливо видимым хромосомным набором. За несколько минут до фиксации добавляют гипотонический раствор, способствующий набуханию хромосом и переходу их в более рыхлое состояние.

После фиксации (смесь уксусной кислоты с метиловым спиртом) суспензию лейкоцитов разбрызгивают на чистые обезжиренные предметные стекла, окрашивают.

Анализ метафазных пластинок проводят при использовании светового микроскопа с окуляром х 10, объективом х 40. Для фотографирования пользуются объективом х 90 с иммерсией. Для составления идиограммы метафазные пластинки фотографируют, делают фотографии, вырезают, раскладывают попарно гомологичные хромосомы и наклеивают их. Кариотип сравнивают со стандартнойидиограммой. При этом можно выявить отклонения в числе или форме отдельных хромосом.

Для идентификации хромосом пользуются рядом показателей:

1.Абсолютная длина каждой хромосомы Lа ,в мкм.

Длина хромосом (Lа) измеряется под микроскопом с помощью окуляр- и объектмикрометра. Поскольку измерение длин хромосом и их плеч

8