Влияние гиперразветвленных полимеров на антиоксидантную активность водных извлечений и меланинов чаги (90

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Сысоева Мария Александровна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Егорова Светлана Николаевна

доктор химических наук, профессор

Медянцева Эльвина Павловна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 18 » марта 2011 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета при ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68, Зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещен на сайте Казанского государственного технологического университета (www.kstu.ru)

Автореферат разослан « 15 » февраля 2011 г.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из сырьевых ресурсов для производства лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) является гриб Inonotus obliquus (Fr.) Pil. -

чага. Современной фармацевтической промышленностью выпускается ряд лекарственных препаратов на основе гриба чага, которые используются для профилактики и лечения онкологических заболеваний, болезней желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы и др., возникающих вследствие воздействия на организм свободных радикалов.

Вредное влияние на организм свободных радикалов можно уменьшить за счет систематического употребления некоторых лекарственных растительных препаратов и БАД,

обладающих антиоксидантной активностью (АОА). Вследствие этого необходимость в создании новых БАД с высокими антиоксидантными свойствами возрастает.

Многие известные препараты на основе чаги производятся путем получения водных извлечений или меланина из гриба. Установлено, что АОА водных извлечений и меланинов чаги возможно повысить при введении в экстракцию комплексонов, изменении рН экстрагента,

обработке водных извлечений из чаги органическими растворителями, т. е. при воздействии различных химических веществ на дисперсионную среду коллоидной системы водного извлечения из чаги. При этом увеличение АОА и извлечений, и меланина происходит, в среднем,

в 2 раза. Фармацевтические исследования последних лет показали эффективность использования гиперразветвленных полимеров (ГРП) с целью улучшения свойств лекарственных препаратов.

При использовании ГРП в процессе получения водного извлечения и меланина чаги можно ожидать значительного повышения их АОА. Поэтому поиск новых, простых в реализации способов значительного повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги является актуальным.

Цель работы: повышение АОА водных извлечений и меланинов чаги при использовании

ГРП.

Задачи, требующие решения для достижения поставленной цели:

-разработка способов повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги с применением ГРП двух поколений - Boltorn Н30 и Н40 в экстракции сырья и при обработке водных извлечений чаги;

-сравнение воздействий ГРП двух поколений, отличающихся количеством концевых функциональных групп, на физико-химические характеристики водных извлечений и меланинов чаги;

3

-определение связи структурной организации меланина чаги, полученного с применением ГРП, с проявлением им АОА;

-установление влияния гидрофобной компоненты, удаляемой из водного извлечения чаги петролейным эфиром, на изменение АОА и структурной организации меланина чаги,

полученного с применением ГРП; - определение влияния антиоксидантных свойств меланинов чаги на проявление ими

гепатопротекторной активности.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность применения водных растворов ГРП Boltorn Н30 и Н40 в экстракции сырья и обработке водных извлечений из чаги для увеличения антиоксидантных свойств извлечений и меланинов чаги.

Установлено, что введение ГРП Boltorn Н30 и Н40 в водное извлечение чаги приводит к изменению структурной организации частиц меланина и его АОА.

Определено, что удаление гидрофобной компоненты из меланина чаги, полученного с применением ГРП, приводит к изменению его физико-химических свойств и снижению АОА, в

отличие от меланина водного извлечения чаги.

Впервые показано, что высокая АОА меланина, полученного с применением ГРП,

способствует проявлению им высоких гепатопротекторных свойств.

Практическая значимость работы. Впервые показана возможность увеличения АОА меланина чаги в 1,5 раза при использовании ГРП Boltorn Н30 и Н40 в экстракции сырья.

Впервые разработан способ введения растворов ГРП Boltorn Н30 и Н40 в водные извлечения чаги, позволивший повысить АОА извлечений и меланинов в 2-4 раза.

Получен меланин чаги с применением ГРП Boltorn Н40, который обладает высокими АОА и гепатопротекторными свойствами (патент 2392953).

Апробация работы. Результаты работы ежегодно докладывались и обсуждались на отчетных научно-технических конференциях КГТУ в 2008-2010 гг. и Всероссийских конференциях «Пищевые технологии» (Казань, 2008-2010 гг.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Итоговая научная конференция КНЦ РАН (Казань, 2009), Первый кластер конференций ChemWasteChem «Разработка лекарственных и физиологически активных соединений на основе природных веществ» (Санкт-Петербург, 2010 г.), IV Международная конференция «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010 г.), VI Всероссийская научно-техническая конференция «Интенсификация тепло- и массообменных процессов в химической технологии»

(Казань, 2010 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 2 статьях в изданиях,

рекомендованных ВАК, 6 публикациях по материалам конференций, 2 патентах на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

4

-способы и полученные результаты по применению ГРП Boltorn двух поколений в экстракции сырья и при введении в водные извлечения из чаги;

-результаты исследований структурной организации полученных меланинов, обладающих высокой АОА;

-результаты по структурной организации и АОА меланинов чаги, полученных с применением ГРП, после удаления из них гидрофобной компоненты;

-экспериментальные данные по проявлению меланинами чаги гепатопротекторных свойств.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав

(литературный обзор, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка использованной литературы из 185 источников, в том числе 58 иностранных. Работа изложена на 135 страницах, содержит 42 рисунка, 25 таблиц.

Автор выражает благодарность руководителю научной работы Сысоевой М. А. за помощь в выборе объектов и методов исследования, обсуждении и интерпретации полученных результатов, а также коллективам химико-биологического корпуса, лаборатории ВОС ИОФХ им. А. Е. Арбузова КНЦ РАН, доц. Зиятдиновой Г. К. за помощь в проведении экспериментальной работы.

5

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен литературный обзор. Охарактеризованы объекты исследования. Рассмотрены способы повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги.

Проанализированы свойства ГРП Boltorn Н30 и Н40 и их использование в фармации. В

заключение обоснована возможность использования ГРП с целью повышения АОА водных извлечений и меланинов чаги.

Во второй главе приведена экспериментальная часть работы. Представлены физико-

химические свойства сырья чаги, использованного для получения водных извлечений: 1-ОАО

«Красногорсклексредства», партия G60706; 2-ОАО «Красногорсклексредства», партия АВВ40707. В работе применены ГРП серии Boltorn H30 и Н40 производства компании Perstorp Speciality Chemicals AB, Швеция. Приведены способы введения ГРП при проведении экстракции чаги и в водное извлечение из чаги. Описаны стандартные методики исследования водных извлечений и меланинов чаги.

АОА определена кулонометрически. Фотон-корреляционная спектроскопия (ФКС)

частиц меланина произведена при помощи коррелометра «ФотоКорр-М». Регистрация электронных спектров поглощения растворов меланина проведена на спектрофотометре

UNICO UV/VIS 2800, ИК-спектров меланина - на спектрофотометре IRPrestigе - 21.

Исследование электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) осуществлено на спектрометре EMX-plus Bruker X-band. Микроснимки меланина получены на сканирующем зондовом микроскопе MultiMode V фирмы Veeco с применением метода прерывисто-

контактной атомно-силовой микроскопии (АСМ). Рентгенфлуоресцентный анализ (РФА)

выполнен на спектрометре Shimatzu EDX-800-HS 2. Тонкослойная хроматография липидов проведена по стандартным методикам на пластинах «Sorbfil».

Оценка острой токсичности и гепатопротекторной активности проведена в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» на половозрелых белых беспородных мышах и крысах обоего пола. Биохимические исследования сыворотки крови подопытных животных осуществлены по общепринятым методам с использованием стандартных наборов ЗАО «ДИАКОН-ДС»

(Пущино) на полуавтоматическом биохимическом анализаторе RAL Clima MC-15.

Третья глава посвящена обсуждению полученных результатов.

Ранее показано, что введение в экстракцию сырья чаги таких комплексонов, как ОДЭФ

(в концентрации 0,146*103 мкмоль/л) и Трилон Б (в концентрации 0,810*103 мкмоль/л),

способствует повышению АОА меланинов чаги до 3 раз. Поскольку ГРП обладают большим количеством функциональных групп на периферии, то, следовательно, они более реакционоспособны, чем комплексоны.

6

Повышение АОА извлечений и меланинов чаги при введении в экстракцию сырья ГРП

Boltorn Н30 и Н40 . Экстракция чаги проведена ремацерацией (повторным настаиванием при 70° С в течение 10 часов). Концентрацию ГРП в экстрагенте варьировали от 0,286*103

мкмоль/л до 0,286*10-7мкмоль/л для Н30 и от 0,196*103 мкмоль/л до 0,196*10-7 мкмоль/л

для Н40. Оценка полученных результатов проводилась по содержанию меланина и АОА извлечений и меланинов (табл. 1). Использование ГРП в концентрациях, оптимальных в случае применения комплексонов, приводит к снижению экстракции меланина и его АОА.

Наиболее высокая АОА достигнута при использовании низких концентраций ГРП, что подтверждает высказывание о возможно большем влиянии ГРП на коллоидную систему водного извлечения чаги, чем комплексоны.

Таблица 1 - АОА меланинов, полученных при экстракции сырья чаги растворами ГРП

При введении в экстракцию ГРП, происходит изменение дисперсионной среды коллоидных систем извлечений чаги. В свою очередь это приводит к изменению их

7

дисперсных фаз, о чем свидетельствуют данные таблицы 2. Изменения и размеров частиц меланина, и их содержания, а также соотношения крупных и мелких частиц в извлечениях,

полученных с применением ГРП, может свидетельствовать об их иной организации по сравнению с частицами меланина водных извлечений из чаги. То есть, введение в

экстрагент Boltorn Н30 и Н40 изменяет дисперсионную среду коллоидной системы водного извлечения чаги, инициируя процессы агрегации и дезагрегации частиц меланина.

Изменение компоновки частиц меланина способствует формированию новых центров,

отвечающих за АОА, либо существующие центры становятся более доступными, а,

следовательно, и более активными.

Таблица 2 - Размер частиц меланина

Влияние ГРП при введении его в экстрагент является достаточно сложным для интерпретации изменения коллоидной системы водного извлечения из чаги в процессе экстракции. Скорее всего, ассоциаты ГРП взаимодействуют с низкомолекулярными соединениями, в первую очередь экстрагируемыми из сырья и затрудняют экстракцию меланина, что подтверждает снижение выхода меланина при использовании высоких концентраций ГРП (табл. 1).

В целом, АОА извлечений и меланинов чаги повышается при использовании ГРП в экстракции сырья. Однако подбор концентрации ГРП в экстрагенте и проведение ремацерации достаточно длительные и трудоемкие процессы, что снижает эффективность применения Boltorn Н30 и Н40 в экстракции.

Повышение АОА водных извлечений и меланинов чаги при введении ГРП в водные извлечения из чаги.

8

Поскольку интерпретация процессов, происходящих при экстракции сырья чаги растворами ГРП, сложна, было осуществлено введение ГРП в водные извлечения из чаги,

полученные ремацерацией. При этом происходит воздействие ГРП на уже сформированную коллоидную систему. При подборе условий проведения эксперимента определено, что с повышением температуры обработки от 20° С до 70° С АОА извлечений и меланинов снижается, что может быть связано с интенсификацией процессов агрегации и дезагрегации частиц меланина, их перекомпоновки. Поэтому, оптимальными условиями выбраны:

температура обработки водного извлечения растворами ГРП 20±5° С, время обработки-1час.

Увеличение продолжительности обработки от 0,5 до 24 ч не влияет на изменения АОА.

При введении Boltorn двух поколений в водные извлечения из чаги происходит значительное увеличение АОА, как самих водных извлечений, так и меланинов чаги,

выделенных из них (табл. 3).

Таблица 3 - АОА обработанных водных извлечений чаги и меланинов из них

После введения в водные извлечения из чаги ГРП 3 поколения АОА извлечений и меланинов, выделенных из них, возрастает в 2 раза, а 4 поколения – в 4. Более значительное повышение АОА извлечений и меланинов чаги при использовании ГРП Н40 по сравнению с Н30, может быть связано с наличием большего числа гидроксильных групп в его молекуле и,

соответственно, большей реакционоспособностью. То есть воздействие Н30 несколько отличается от воздействия Н40, поскольку размер молекул Н30 составляет 2 нм, а Н40-2,5 нм. В

водной среде молекулы Boltorn образуют ассоциаты. Эти ассоциаты могут сильно отличаться по размерам в зависимости от рН среды и ее компонентного состава. Для определения размеров ассоциатов Boltorn в дисперсионной среде водного извлечения из чаги на основе литературных данных создана модель дисперсионной среды (полисахарид - 3,60 %, общая зола – 2,90 %,

щавелевая кислота – 1,22 %, уксусная кислота – 0,33 %, муравьиная кислота – 0,23 %). В

9

модель дисперсионной среды были введены растворы ГРП в условиях, подобранных для введения в водные извлечения чаги. С помощью ФКС определены размеры ассоциатов ГРП

(табл. 4).

Полученные данные свидетельствуют о взаимодействии ассоциатов ГРП с дисперсионной средой, в результате которого происходит уменьшение их размера, что может повышать их реакционную способность при взаимодействии с компонентами дисперсионной среды.

Таблица 4 - Размер ассоциатов ГРП в воде и модели дисперсионной среды

Влияние ГРП на дисперсионную среду должно привести к перекомпоновке дисперсной фазы за счет процессов агрегации и дезагрегации частиц, что наблюдается по изменению их размеров (табл. 5).

Таблица 5 - Распределение крупных частиц меланина водных извлечений чаги и водных извлечений чаги, обработанных ГРП

На снимках, полученных с помощью АСМ (рис. 1), отчетливо видны изменения не только размера, но и формы частиц меланина, происходящие после введения ГРП в водные извлечения.

Данные, полученные с помощью ФКС, хорошо согласуются с данными АСМ. Таким образом, отличие размеров и формы частиц меланинов связано с изменением их компоновки,

что отражается на изменении их АОА под воздействием ГРП.

10