63. Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем.

Прокариотические системы экспрессии успешно пользуются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические пострансляционные модификации - гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому было решено попытаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариотических экспрессирующих векторов.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. cerevisiae. Их генетика хорошо изучена, а, кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах и они считаются безопасными в обращении. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. Сегvisiae было получено множество самых разных белков аутентичных природным (вакцины против гепатита В, малярии, инсулин, факторы роста и свертывания крови). Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались посттрансляционной модификации, к тому же с выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков.

В поисках других эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно было бы получать биологически активные белки, исследователи сосредоточили усилия на создании экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов, в частности бакуловируса AcMNPV, инфицирующего клетки многих насекомых. Клетки насекомого, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, синтезировали клонируемый белок.

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих (например, на основе обезьяньего вируса SV40) используются для изучения функций и регуляций генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые могут использоваться в медицинских целях. Однако промышленный синтез с использованием модифицированных клеток млекопитающих обходится слишком дорого и может применяться только для получения рекомбинантных белков, которые невозможно получить другим путем. Примером может служить производство рекомбинантного эритропоэтина. Эритропоэтин – белок гликопротеид в организме человека регулирует процессы созревания (дифференцировки) эритроцитов. Препараты на основе эритропоэтина используют для лечения рака, болезней крови, почек, для повышения выносливости человека к физическим нагрузкам (допинг-препараты). Поскольку бактериальные клетки не способны к гликозилированию белков человека, ген эритропоэтина встраивают в яйцеклетки китайского хомячка, которые далее культивируют поверхностным способом в виде монослоя клеток. Такая сложная технология получения обусловливает высокую стоимость препаратов на основе генноинженерного эритропоэтина.

64. Основные принципы получения трансгенных организмов.

Процесс создания трансгенного организма достаточно сложен и часто требует индивидуального подхода. Однако в любом случае его можно подразделить на несколько общих этапов:

1. Получение (выделение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса. Ген может быть выделен из естественных источников (из подходящего генома) или из геномной библиотеки; синтезирован искусственно — химическим (по имеющейся последовательности нуклеотидов) или ферментативным (с использованием механизма обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы) путем; получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Создание специальных генетических конструкций — векторов (переносчиков), в составе которых содержатся гены (трансгены), которые будут внедряться в геном другого вида или экспрессироваться в клетках про- или эукариот. Для конструирования рекомбинантной ДНК (рекДНК) векторную ДНК (например, плазмиду) и чужеродную ДНК, содержащую интересующий ген (трансген), разрезают одной и той же рестриктазой; в результате образуются одинаковые концы. К генам, синтезированным химическим путем или полученным по матрице их мРНК, такие концы можно «пришить» искусственно. Затем производят смешивание фрагментов ДНК (вектора и трансгена) и «сшивание» их ДНК-лигазой. Концы чужеродной ДНК и плазмиды взаимодействуют друг с другом, образуя комплементарные пары оснований. Происходит гибридизация векторной и чужеродной ДНК. Концы фрагментов замыкаются с помощью водородных связей и ковалентно «сшиваются» с помощью фермента ДНК-лигазы.

3. Генетическая трансформация, т. е. перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента (например, Е. coli). Плазмида, встроенная в бактерию, ведет себя, как вектор (переносчик) нового гена, который реплицируется в каждом новом поколении.

4. Молекулярная селекция — отбор трансформантов, т. е. клонов, несущих рекДНК. В процессе генетической трансформации Е. coli могут образоваться три типа клеток: клетки, не содержащие пламиду, содержащие плазмиду без встройки (без рекДНК), содержащие плазмиду с рекДНК. Для отбора трансформантов среди нетрансформированных клеток используют различные маркерные гены, которые находятся в векторной молекуле наряду с трансгеном.

Так, плазмида pBR322 имеет два гена устойчивости к антибиотикам ампициллину (Атрг) и тетрациклину (Tetr). Один из генов служит для идентификации бактерий, несущих плазмиду (вектор) путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику, а другой — для отличия гибридной плазмиды (рекДНК) от исходного вектора. В гене Tetr имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой ВатШ. Если разрезать вектор в гене Tetr рестриктазой BamHl и встроить в него фрагмент чужеродной ДНК, полученный с помощью той же рестриктазы, то ген Tetr инактивируется, и у бактерий, несущих плазмиду, исчезает устойчивость к тетрациклину, но сохраняется устойчивость к ампициллину. Отбор на среде с ампициллином покажет, содержит Е. coli плазмиду или нет. Содержащие плазмиду бактерии будут расти на среде с ампициллином. Для отбора клеток, несущих чужеродную ДНК (интересующий нас ген), бактерии выращивают на среде с тетрациклином. Трансформированные клетки устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (такие колонии отсутствуют на среде с тетрациклином), так как ген устойчивости к тетрациклину разрушен в результате вставки фрагмента чужеродной ДНК. Помимо плазмиды pBR322, используется множество других векторов для клонирования (pUC19, рЕТ, pQE), причем для некоторых из них существуют весьма остроумные системы отбора рекомбинантных клонов (например, окрашивание колонии клеток, содержащих немодифицированную плазмиду pUC19).

5. Выращивание измененных клеток в целые трансгенные организмы. Синтез определенного белка — продукта введенного гена.

Первый, второй и третий из перечисленных этапов представляют собой последовательное создание рекомбинантной ДНК, четвертый и пятый — трансгеноз и выявление трансгенного организма.

После введения в реципиентную клетку фрагмента чужеродной ДНК происходит ее клонирование с целью получения большого числа копий или начинается синтез продукта, закодированного во введенном гене. Чаще всего эти процессы осуществляются в бактериальных клетках. Поэтому клонирование прокариотической ДНК в клетках прокариот не вызывает осложнений. Клонирование эукариотической ДНК требует дополнительных методических приемов, так как существуют различия в строении генома у прокариот и эукариот. У прокариот кодирующие домены структурных генов непрерывны, а у эукариот кодирующие области (экзоны) разделены некодирующими (нитронами). Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических мРНК в бактериальных клетках невозможна. Для удаления интронов из эукариотической ДНК был предложен метод синтеза ДНК-копии (кДНК) на мРНК.

84