57. Способы индентификации трансгенной днк.

К выделенной из образца ДНК добавляют несколько пар праймеров, специфичных к консервативным областям маркерных генов и регуляторных участков ДНК, обычно используемых при трансформации растений. Проводят реакцию мультиплексной ПЦР в выбранном режиме. Накопление флуоресцентно меченых одноцепочечных ПЦР-продуктов достигается за счет избытка в каждой из пар одного из праймеров, содержащего на 5'-конце флуоресцентную метку. Полученные продукты ПЦР гибридизуют на биочипе с иммобилизованными зондами, комплементарными последовательностям фрагментов детектируемых генов и/или регуляторных элементов.

Биочипы представляют собой массив микроячеек гидрогеля, закрепленных на поверхности стекла. В ячейках иммобилизован набор олигонуклеотидов, гомологичных фрагментам трансгенных последовательностей ДНК. Каждая из ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид, причем иммобилизованные олигонуклеотиды имеют иную последовательность, чем праймеры на те же гены. Помимо этого, на биочипе расположены ячейки с неспецифическими олигонуклеотидами, выполняющие роль отрицательного контроля гибридизации, а также ячейки, маркированные флуоресцентным красителем и предназначенные для правильной ориентации биочипа. Позиция на биочипе всех ячеек, как опытных, так и контрольных, строго детерминирована. Поверхность биочипа, на которой расположены микроячейки, закрыта пластиковьм корпусом гибридизационной камеры, которая вместе со стеклом образует замкнутое пространство, служащее для проведения гибридизации. Корпус камеры снабжен отогнутым краем для удаления камеры после проведения гибридизации и двумя отверстиями для внесения образца, которые герметизируются при помощи липкой ленты.

Изучаемые фрагменты ДНК образуют совершенные стабильные гибридизационные дуплексы только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК могут формировать лишь нестабильные несовершенные дуплексы. Дифференциацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс, во много раз выше, чем в ячейке, где мог формироваться лишь несовершенный дуплекс. При этом детерминированный порядок расположения олигонуклеотидов в ячейках биочипа дает возможность установить, какие именно маркерные гены и регуляторные элементы входят в состав трансгенной ДНК. Результаты гибридизации могут быть интерпретированы однозначно как визуально, так и с помощью программы "Imageware", входящей в состав аппаратно-программного комплекса "Чипдетектор-03" для анализа флуоресцентных изображений, получаемых на биочипах.

Таким образом, одним из аспектов изобретения является набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в таблице 1, используемых в качестве праймеров для ПЦР в способе идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе такого материала.

Еще одним аспектом изобретения является биочип, представляющий собой микроматрицу с ячейками, одни из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотиды-зонды, другие - олигонуклеотиды для контроля на процедуру тестирования, а третьи - флуоресцентные красители для правильной ориентации биочипа при регистрации результатов, отличающийся тем, что в качестве зондов использованы олигонуклеотиды, приведенные в таблице 2, комплементарные фрагментам типичных маркерных и вспомогательных последовательностей ДНК, используемых при генетической трансформации растений.

Следующим аспектом изобретения является способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе такого материала, включающий анализ ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и регистрацию результатов анализа, отличающийся тем, что: а) ПЦР проводят на препарате ДНК в виде мультиплексной реакции с получением флуоресцентно меченого продукта, при этом используют специфические пары праймеров, один из которых флуоресцентно мечен и присутствует в избытке по отношению ко второму немеченому праймеру; б) результаты ПЦР анализируют с помощью гибридизации на биочипе и в) результаты анализа регистрируют с помощью алпаратно-программного комплекса, позволяющего отображать флуоресценцию ячеек биочипа на экране компьютера, количественно определять флуоресцентный сигнал в любой точке биочипа, определять отношение флуоресцентного сигнала к фону в каждой ячейке биочипа и соответственно соотношение флуоресцентных сигналов в ячейках.

В способе согласно изобретению регистрация результатов гибридизации по п.3(в) может быть выполнена с помощью аппаратно-программного комплекса "Чипдетектор-03", который позволяет преобразовать полученные результаты в цифровом формате и производить последующую математическую обработку.

Кроме того, в способе по изобретению при необходимости усиления гибридизационного сигнала реакцию ПЦР по п.3(а) можно проводить в две стадии, сначала как симметричную мультиплексную ПЦР, а затем как асимметричную мультиплексную ПЦР с включением флуоресцентно меченых праймеров.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявленный способ отличается от вышеописанного метода идентификации двух регуляторных элементов трансгенной ДНК с помощью традиционной ПЦР по нескольким параметрам. Во-первых, заявленный способ позволяет существенно увеличить число детектируемых мишеней и, в то же время, снизить трудоемкость благодаря использованию мультиплексной ПЦР. Во-вторых, процедура гель-электрофореза прототипа, связанная с применением токсических веществ и ручного труда, заменена в заявленном способе на гибридизацию на биочипе, практически не требующую трудовых затрат и участия персонала. В-третьих, размеры амплифицируемых фрагментов в заявленном способе существенно меньше, чем в прототипе, что позволяет анализировать существенно более деградированную ДНК. В-четвертых, применение в заявленном способе регистрации результатов с помощью специального аппаратно-программного комплекса "Чипдетектор-03" позволяет установить уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в каждой ячейке и однозначно интерпретировать результаты гибридизации.