31. Особенности культивирования клеток животных, виды культур.

Первые опыты по культуре животных тканей были проведены немецким биологом В. Ру, которому удалось в 1885 г. в течение нескольких дней поддерживать развитие нервной пластинки куриного эмбриона в теплом солевом растворе. Однако лишь предложенная американским биологом Р. Гаррисоном в 1907 г. воспроизводимая техника послужила основой для дальнейшего развития метода культивирования животных клеток вне организма. Культивируя в сгустках лимфы небольшие кусочки нервной трубки эмбриона лягушки, Гаррисон через несколько недель наблюдал образование нервных волокон. Французский хирург и патофизиолог А. Каррель, сумевший в течение 34 лет сохранять у штамма клеток сердца куриного эмбриона способность к активным делениям, доказал таким образом, что животные клетки могут неограниченно долго расти в культуре in vitrо.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований − от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ.

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов и ферментеров, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению. Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях. Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой так же решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны. При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной (batch), стационарной с подпиткой (fed- batch) или непрерывной (continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры. Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно. При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост — лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста.

Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность. Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик. Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.