28. Методы культивирования вирусов

Культивирование вирусов. Путем заражения лабораторных животных. Путем заражения куриных эмбрионов. Путем заражения клеточных культур, которые получают из нормальных или злокачественных клеток человека, или животных. Виды клеточных колоний: полуперевиваемые перевиваемые.

29/30. Культуры клеток, их виды

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и лабораторных животных. Наиболее широкое применение нашли однослойные культуры трипсинизированных клеток, а также перевиваемые клеточные линии, которые получают из различных органов и тканей животных и человека. Для поддержания их жизнедеятельности используют пита­тельные среды (среда 199, Игла и др.), содержащие полный набор веществ, необходимых для роста клеток вне организма (аминокислоты, углеводы, витамины и др.), а также определен­ный солевой состав и рН. Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей, овец, свиней, кроликов, морских свинок и других животных, а также почеч­ных клеток взрослых обезьян. Эмбриональные ткани обладают большей потенцией к росту, чем ткани взрослых животных. Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток нормальных тканей человека, животных (СОЦ — сердце обезьян циномольгус, КК—почки кролика и др.) и тканей злокачественных опухолей. Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей.

В зараженных культурах ткани одни вирусы проявляют свое цитопатическое действие в течение нескольких дней (вирусы оспы, полиомиелита и др.), другие — спустя 1—2 нед (аденовирусы, вирусы парагриппа и др.) в зависимости от особенностей, количества вирусов и свойств клеток. Цитопатический эффект выражается в различных изменениях морфоло­гии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантские многоядерные клетки), в полной деструкции монослоя. Кроме того, вирусы в зараженных клетках вызывают образование внутриклеточных включений, специфического вирусного анти­гена, обнаруживаемого методом иммунофлюоресценции, и др.

Для культивирования вирусов в курином эмбрионе вируссодержащий материал вводят в амниотическую, аллантоисную Полость, желточный мешок, внутривенно, в мозг, в тело эмбриона, на аллантоисную мембрану (рис. 23). Специфические поражения в куриных эмбрионах развивают­ся в виде очагового поражения, диффузного помутнения оболо­чек, отека с обильными язвами, участками некроза, кровоизли­яний, пустул, пузырьков и др. (рис. 24). Эти изменения эмбриона характеризуют специфический вирусный инфекцион-ный процесс. Репродукцию вируса в курином эмбрионе обнару­живают реакцией гемагглютинации. Культивирование вирусов проводят также в организме чувствительных лабораторных животных, особенно тех вирусов, которые не репродуцируются в культурах тканей и куриных эмбрионах.

31. Изменчивость микроорганизмов

Исследователи, стоявшие у истоков бактериологии, столкнулись с разнообразием видов бактерий и кажущейся возможностью метаморфоз, взаимопревращений одних бактерий в другие создали учение о плеоморфизме, которое утверждало, что бактерии обладают огромной биологической пластичностью и способны по необходимости принимать любую из множества морфологических форм и физиологических функций.

Однако, метод получения чистых культур, разработанный Кохом, показал, что до него все бактериологи, включая Пастера, работали со смешанными культурами. Возникло противоположное направление – мономорфизм, отрицавшее изменчивость у бактерий, оно просуществовало около 50 лет.

В пору бурного расцвета генетики многоклеточных организмов – в 20-30-е годы, учения о наследственности и изменчивости бактерий не существовало. Наблюдавшиеся иногда изменения свойств бактерий в чистых культурах исследователи связывали с адаптацией к определенной питательной среде или виду хозяина с возможностью к последующей реадаптации, т.е. к возврату исходного признака.

Наблюдая изменчивость у микроорганизмов, исследователь оперирует понятием «признак». У микроорганизмов признаки можно подразделить на:

Морфологические (размер, форма, наличие жгутиков и капсул).

Биохимические (способность расщеплять сахара, синтезировать аминокислоты).

Антигенные признаки.

Биологические (патогенность, тропность).

Резистентность к лекарственным веществам.

Все признаки являются следствием комплекса биохимических реакций, контролируемых ферментами.

Фенотипическая изменчивость. Или ненаследственная, модификационная. Причины изменчивости – влияние внешних факторов (биологических, химических, физических), блокирующих на время нормальную работу фермента. Примеры: если в питательную среду добавить пенициллин, то он блокирует фермент транспептидазу, тормозится образование клеточной стенки, образуется L-форма бактерий, совсем не похожая на исходную. Если такую культуру пересеять на среду без пенициллина – морфология восстановится.

Особенно ярко фенотипическая изменчивость проявляется в старых культурах микроорганизмов после длительного культивирования без пересева – меняется форма, размеры бактерий, их способность воспринимать краситель (тинкториальные свойства). Пример: в старых культурах стафилококк становится Гр-, кишечная палочка принимает кокковидную форму, дифтерийная палочка образует нитевидные, кокковидные дрожжеподобное формы. Под воздействием лекарственных веществ меняется форма колоний, их цвет. При добавлении в питательную среду небольшой концентрации этилового спирта у бактерий подавляется образование жгутиков. Однако, при восстановлении нормальных условий культивирования все исходные признаки восстанавливаются. Таким образом, модификации не затрагивают генотип и, следовательно, не передаются по наследству.

Модификации – это адаптивные реакции на изменение условий внешней среды.

Наследственная изменчивость. Генотипическая изменчивость.

Обусловлена изменениями, происшедшими в ДНК. В основе наследственной изменчивости лежат 2 процесса:

Мутации – наследуемые изменения последовательности азотистых оснований ДНК.

Рекомбинации – обмен участками ДНК между бактериями, одна из которых является донором, а другая – реципиентом.