21. Электронная микроскопия в диагностике вирусных болезней.

В 1931 г. немецкие ученые Кноль и Руска создали первый в мире просвечивающий электронный микроскоп. Источником электронов в электронном микроскопе служит нить накаливания — катод. Электроны, испускаемые катодом, ускоряются в электрическом поле с разностью потенциалов между катодом и анодом от нескольких десятков до сотен тысяч вольт в глубоком вакууме (до 10^-6 мм рт. ст.). Магнитное поле конденсорной линзы сужает поток электронов в пучок, который проходит через исследуемый объект. При этом

траектория движения электронов отклоняется под различными углами. Измененный пучок электронов попадает в поле линзы объектива, в котором формируется первичное промежуточное увеличенное изображение объекта. Это промежуточное изображение объекта увеличивается еще раз с помощью проекционной линзы и создает конечное изображение объекта. Конечное изображение возникает на флуоресцирующем экране и может быть экспонировано на фотопластинку или фотопленку. В современных электронных микроскопах первого класса максимальное увеличение достигает 2 000 000, а гарантируемое разрешаемое расстояние ± 0,14 нм.

По характеру исследования объектов различают микроскопы просвечивающего типа, сканирующие, эмиссионные, теневые. Наиболее распространены электромагнитные микроскопы просвечивающего типа.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. При работе с электронным микроскопом важное значение имеет каждый этап приготовления препаратов. Для просвечивающего электронного микроскопа исследуемые объекты должны быть в виде очень тонких срезов (до 40...60 нм) или вирусных суспензий, которые помещают на специальные медные сетки, или бленды. Для удержания суспензий над отверстиями сетки ее покрывают тонкой пленкой - подложкой, изготовленной из коллодия и укрепляют напылением углерода.

Различные структуры биологических объектов и пленка-подложка почти в одинаковой степени рассеивают электроны, и изображение объекта не будет выявлено. Поэтому необходимо предварительно создать различную электронную плотность между фоном и препаратом или между структурами биологических объектов. В качестве контрастирующих веществ наиболее широкое распространение получили 1...2%-е водные растворы фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой, осмиевой кислоты, растворы уранилацетата и уксуснокислого свинца. Методы негативного и позитивного контрастирования широко применяют при исследовании биологических объектов в виде суспензий.

При негативном контрастировании контрастирующее вещество высокой электронной плотности окружает объект более низкой плотности и он становится видным на более плотном окружающем его фоне. Время контрастирования препарата составляет секунды (в среднем 15...40 с). Для получения позитивного контрастирования время реагирования контрастирующего вещества с объектом измеряется в минутах и часах. Соединяясь с определенным веществом объекта, атомы и молекулы тяжелых металлов повышают контрастность соответствующих структур, обеспечивая позитивное контрастирование объекта. При позитивном контрастировании избыток контрастирующего вещества фона объекта удаляется промыванием дистиллированной водой, и объект выглядит более плотным на более светлом окружающем фоне.

При изучении молекул белков нуклеиновых кислот, а иногда и вирусов также применяют методы контрастирования оттенением, путем испарения металла в вакууме. Атомы металла разлетаются от места распыления под некоторым углом к исследуемому объекту и осаждаются на его поверхности слоем различной толщины. Вследствие этого участки объекта имеют различную электронную плотность и возникает изображение объекта.

Другой метод - углеродных реплик с предварительным оттенением. Сущность реплик заключается в том, что рельеф поверхности объекта воспроизводится с помощью тонкой пленки, которая затем исследуется в электронном микроскопе.

Электронно-микроскопическая диагностика и морфология вирусов. Изучение морфологии вирусов - важный этап при определении их таксономической принадлежности. Материалом для электронно-микроскопических исследований вирусов могут быть смывы из глаз, со слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, содержимое кишечника, срез пораженного участка эпидермиса кожи или оспенные корочки, кусочки органов и тканей больных и павших животных. При работе с вирусами в лаборатории исследуют вируссодержащую культуральную жидкость, аллантоисную жидкость куриного эмбриона, кусочки органов и тканей зараженных животных. При подготовке препаратов для таких исследований большое значение имеют концентрация вируса в материале и степень его контаминации различными балластными веществами. В зависимости от этих факторов и выбирают методику подготовки исходного материала. В большинстве случаев необходима предварительная очистка и концентрация вирусов. Кусочки органов, тканей и фекальный материал гомогенизируют, а затем концентрируют центрифугированием или другими методами.

Для выделения вируса из зараженных клеток культуры тканей их предварительно разрушают в стеклянном гомогенизаторе ультразвуком или замораживанием—оттаиванием, затем осветляют низкоскоростным центрифугированием и концентрируют. При исследовании кусочков пораженной кожи или корочкового материала при болезнях, вызываемых вирусами покс-группы, используют метод давленых препаратов или метод отпечатков. Материал смывов предварительно гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе, затем грубо фильтруют и концентрируют ультрацентрифугированием или ультрафильтрацией. Без предварительной очистки и концентрации препараты можно готовить из вируссодержащей культуральной жидкости культуры тканей и аллантоисной жидкости зараженного куриного эмбриона, если титр вируса в них не меньше 10⁵ ЛД₅₀/мл.

Иммунная электронная микроскопия. Это специфический метод для выявления (идентификации) и титрования вирусов. Он позволяет выявить вирус в образцах, в которых его нельзя обнаружить при простой электронной микроскопии. При взаимодействии вируса со специфической антисывороткой образуется комплекс в виде агрегатов вируса и образования вокруг вирусной частицы ореола из окружающих антител. Образование агрегатов вирусных частиц позволяет концентрировать вирус при более низких оборотах центрифуги, чем при концентрации нативного вируса.

Препараты готовят из предварительно очищенной суспензии вируса, смешивая ее с различными разведениями специфической антисыворотки. Через 18 ч контакта смесь концентрируют центрифугированием при 17 000...31 000 мин^-1 в течение 1...1,5 ч. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде: контрастируют и помещают на предметные сетки с нитроцеллюлозной подложкой. Сеточки подсушивают и просматривают под электронным микроскопом при увеличении в 30 000...50 000.

Электронно-микроскопическая экспресс-диагностика болезней животных (на примере вируса оспы) методически осуществляется следующим образом. Используют биопсийный материал прижизненно или материал от убитых или недавно павших от оспы животных. Можно брать срез верхушки оспины пораженного эпидермиса кожи животных. Препарат готовят методом давленых препаратов для адсорбции на сеточки вирионов из взятых для исследования материалов и методом отпечатков. Исследования проводят на электронном микроскопе с разрешающей способностью не более 0,5 нм. Диагноз считается положительным при наличии в препаратах одиночных или расположенных группами оспенных вирионов характерной кирпичеобразной формы с закругленными краями, размером 250...300 х 150...200 нм.

При отсутствии в препаратах вирионов ставят биопробу на восприимчивых животных, используя оставшийся материал; исследования проводят в установленном порядке.