Антитела

Это специфические белки, вырабатываемые лимфоцитами в ответ на попадание в организм чужеродных структур. Взаимодействие антиген-антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. Связывание белков антител с антигенами происходит по принципу комплементарности за счёт Вандерваальсовых, ионных и водородных связей. Константа связывания реакции антител с антигеном может составлять 10 в 6 - 10 в 9 л/моль. Т.О., биосенсоры на основе антител чаще всего явл. одноразовыми. Образование комплекса антитела с антигеном можно зарегистрировать непосредственно или косвенно. Непосредственно можно зарегистрировать изменение массы с помощью пиезо-аккустического преобразователя или с помощью метода поверхностного плазмодного резонанса. Связывание антитела с антигеном может быть зарегистрировано с помощью оптических преобразователей, основанных на регистрации флуоресценцией. Для этого антитело или антиген связывают с флуоресцентной меткой. В биосенсорах электро-хим. типа для определения комплекса антител и антигена используют ферментную метку. Т.О., антитела можно использовать в сочетании со всеми типами преобразователей. С3

Достоинства: практически абсолютная селективность, высокая чувствительность

Недостатки: одноразовые; связывание антигена тяжело зарегистрировать

Рецепторы клеток

Хотя оболочка бактерий представляет собой лишь тонкий слой, она служит достаточно надёжным препятствием для многих молекул. Многие молекулы, например, гормоны не проникают внутрь клетки, а взаимодействуют с её рецепторами. Они находятся внутри клеточной мембраны и представляют собой белки, полипептидная цепь которых пронизывает толщину мембраны. Ве-ва связываются с рецепторами за счет ионного взаим-вия, Вандерв. сил и гидрофобных вз-вий.

Нуклеиновые ки-ты

Способность одноцепочечной молекулы ДНК связываться с комплементарной ей парой является основой для ДНК-биосенсоров. ДНК-Биосенсоры чаще всего используют для того, чтобы понять присутствует ли в пробе определённая ДНК или нет. Образование гибридного комплекса между молекулами ДНК можно зарегистрировать методом поверхностного плазмодного резонанса, но перед этим надо синтезировать последовательность ДНК, которая будет комплементарна последовательности определяемых ДНК. Кроме того, для определения ДНК исп. косвенную регистрацию с исп. разных методов. Чаще всего это флуоресцентные метки, ферментные метки и метки на основе электро-активных соед.

Иммобилизация биологического материала Сущ. различные классификации методов иммобилизации. Чаще всего методы разделяют на Обратимые и Необратимые. В случае обратимой иммобилизации биокатализатор может быть отделен от подложки без потери биологической активности. Обратимо иммобилизованный материал можно получить адсорбцией, ионным, аффинным и металлохилатным связыванием. К методам необратимой иммобилизации относят: капсулирование, включение в гели, сшивку и ковалентное связывание. По ещё одной классификации методы иммобилизации разделяют на ковал. и нековал. Нековал. (физ.) иммобилизация не предполагает образов. хим. связей между биоматериалом и преобразователем. Ковал. иммобилизация предполагает образование одной или нескольких ковал. связей между функциональными группами биоматериала и подложки. Метод выбирают исходя из критериев стабильности биоматериала, его доступности для ре-ции с определ. ве-вом и способом регистрации аналитич. сигнала. С4 Адсорбция Наиболее простой метод иммобилизации, не требующий большой подготовки компонентов сенсоров. Адсорбцией пользуются главным образом на стадии исследования, когда достаточно слабого прикрепления биоматериала к преобразователю, а от сенсора не требуется длительной эксплуатации. Белки можно адсорбировать на поверхности многих материалов, например, оксида алюминия, угля, глины, силикагеля, стекла и тд. Для адсорбции не требуется никаких доп. реагентов. Метод практически не нарушает нативные конформации белков, однако биологический материал располагается неупорядоченно. Адсорбция может быть физическая или хим. При физической между биоматериалом и носителем образ. относительно не прочные связи, они обусловлены Вандерваальсовыми взаимод. или водородными связями. Адсорбированый биоматериал очень чувствителен к изменению pH, t, ионной силы и конц. субстрата. Капсулирование В отличие от др. методов иммобилизации при капсулировании главным явл. удерживание ра-ра окруж. биоматериала. На поверхности преобразователя удерживаются исх. ра-ры, содержащие биоматериал. Для капсулирования используют различные полупроницаемые мембраны. С их помощью осущ. контроль размера молекул, проникающих внутрь капсулы или выходящих из неё. Большие молекулы или частицы, такие как ферменты, удерживаются внутри капсулы, а молекулы субстрата свободно проходят через мембраны. Капсулирование легко применить к разным моделям сенсоров каталитического типа. Он обеспечивает хорошую воспроизводимость работы и предохраняет биоматериал от загрязнений и разрушений. В целом, капсулирование фермента устойчиво к изменению рН, t, ионной силы и хим. состава среды. Метод позволяет достичь тесного взаимод. биоматериала и преобразователя. При капсулировании используют мембраны из ацетата целлюлозы или из политетрафторполиэтилена (тефлон). Применение различных полупроницаемых мембран может позволить повысить селективность определения с помощью микробных сенсоров. Включение Одним из наиб. эффективных методов иммобилизации целых клеток явл. Включение их в гели. Полимерные гели предотвращают вымывание клеток и обеспечивают доступ субстрата и О₂. Гель-это система полимер-растворитель, пространственная сетка которой стабилизирована по всему объёму устойчивыми межмолекулярными связями. Природа этих связей определяется хим. строением гелеобразователей и способами получения соответ. гелей. С5

С3

С4

С5

Различают гели 1 и 2 рода. Пространственная сетка гелей 1 рода образована ковалентными связями. В гелях 2 рода пространственная сетка поддерживается за счёт водородных связей, гидрофобных взаимодействий и других сил нековалентной природы. Известный пример геля 1 рода - явл. полиакриламидный гель.

Синтез полиакриламидного геля в присутствии биокатализатора сложный и неодинаковый для разных типов клеток процесс. Одновременно протекает большое число различных реакций компонентов смеси друг с другом и с микроорганизмами.

Важным положительным св-вом полиакриламидных гелей является устойчивость материала в кислых и щелочных средах, но при иммобилизации микроорганизмов полиакриламидный гель наблюдается снижение их биокаталитических св-в. Для формирования иммобилизованных биокатализаторов кроме полимеризации может исп. и поликонденсация. Так, для иммобилизации микроорганизмов широкое распространение получили полиуретановые матрицы

Уретановые матрицы устойчивы в нейтральных и щелочных средах. Они разрушаются лишь в сильно кислой среде, где биоматериал итак обычно не устойчив.

Ещё один часто применяемый полимер - поливиниловый спирт. Это доступный продукт промышленного синтеза, а каждая его марка стандартизирована. Гели поливинилового спирта могут быть получены воздействием на водные растворы ПВС, уф-облучения или потока электронов.

n(O=C=N-R-N=C=O) + n(HO-R’-OH) […-CO-NH-R-NH-COO-R’-O-…]n

Структура геля ПВС, сшитого УФ-облучением

В некоторых случаях поливиниловый спирт малопригоден для иммобилизации микроорганизмов, тк в виде тонких плёнок он обладает низкой механической прочностью. Известно несколько методик модификаций поливинилового спирта, в частности, путем воздействия борной ки-ты, сополимеризации с винил-пиридином, винил-перолидоном и стерил-пиридином. Новым подходом к созданию рецепторного элемента биосенсора явл. разработка мягких методов получения неорган. матриц, чаще всего такие матрицы получают с исп. в золь-гель-методах.

Золь-гель метод-метод получения материалов, включающий получение золя с последующим переводом его в гель. В основе Золь-гель метода лежат процессы контролируемого гидролиза алкоксидов кремния или различных металлов в водной среде. Золь гель метод по сравнению с традиционной схемой получения неорган. материалов обладает упрощённой технологией синтеза. Данный метод позволяет достичь снижение энергозатрат и высокую степень чистоты продуктов на всех стадиях синтеза. Несмотря на кратковременность процесса, в ходе такого метода иммобилизации часто возникают сложности с сохранением жизнеспособности микроорганизмов. Чаще всего это происходит из за экстремальных для клеток значений pH или высоких конц. образующихся спиртов. Привлекательным св-вом неорган. матриц явл. их высокая механическая прочность и постоянство занимаемого носителем объёма. Примеры гелей 2 рода - гели желатина, агара, агарозы, крахмала и др. Для данных гелевых матриц характерно Обратимое плавление, поэтому их часто называют термообратимые. Поливиниловый спирт способен образовать гели и 1 и 2 рода. Это происходит благодаря наличию гидроксильной группы у каждого второго углеродного атома.

Структура крио-геля

Формула хитозана. Крио-Гели поливинилового спирта образуются при замораживании конц. растворов поливинилового спирта. Для иммобилизации клеток микроорганизмов часто используют ионотропные гели. У них роль мостиков между макромолекулами выполняют ионы. Пример ионотроп. геля - хитозан (основание), хорошо растворим в разб. р-рах кислот. Формирование ионотропных гелей хитозана происходит когда в раствор вводят анионы, образующие малодиссоциирующие солевые мостики между макромолекулами. Чаще всего для этого исп. фосфаты или сульфаты. C6

Структурная формула хитозана. Хитозановые носители с включёнными в них микроорганизмами устойчивы в нейтральных и щелочных средах. Кроме того, их стабильности способствует использование в биосенсьрных системах фосфорных буферов Ещё одним примером ионотроп. гелей - альгинатные гели.

Сшивка

Формирование ковал. связей между молекулами биоматериала. Для неё исп. бифункциональные реагенты, т. е. Реагенты с высоко функциональными группами. Рис. Бифункциональные реагенты для сшивки. С7 Рис. Сшивка Амино-групп белка глутаровым альдегидом. С8

Полученная матрица из сшитого биоматериала удерживается на пов-ти преобразователя физически. Как и в случае капсулирования диффузия субстрата через такие матрицы снижается. Чаще всего метод сшивки исп. в сочетании с другими методами иммобилизации для повышения стабильности получ. рецепторных элементов. Недостаток метода - потеря активности биоматериала и низкая механическая прочность получаемых рецепторных элементов.

Ковалентное связывание

Этот метод связывания позволяет создавать биосенсоры в которых биокомпонент остаётся иммобилизованным в течение всего срока эксплуатации сенсора. В данном подходе заранее известно через какие функциональные группы Биоматериал прикрепляется к носителю. Чаще всего для получения нужных функциональных групп поверхность преобразователя модифицируют. Ковалентное связывание обычно производят через амино-, карбоксильные и гидроксильные группы.

С6

С7

С8

Принципы функциониров. биосенсоров на основе различ. типов преобразователей

Потенциометрические биосенсоры

Потенциометрия-метод исследования и анализа ве-в, основан. на зависимости равновесного электродного потенциала от активности определ. ве-ва в исследуемом ра-ре. Эта зависимость описывается ур. Нернста: Е = Е0 +

В потенциометрических биосенсорах применяют мембранные ионселективные электроды. Важнейшей частью таких электродов явл. полупроницаемая мембрана, отделяющая внутренний ра-р электрода от анализируемого. При сопряжения мембранного ионселективного электрода с ферментом получается ферментные потенциометрический электрод. В ходе ферментативной реакции в растворе накапливаются продукты реакции, которые способны менять потенциал электрода. + потенциометрических биосенсоров явл. отсутствие расхода ве-в, при этом потенциометрические сенсоры имеют два серьезных недостатка: *Необходимо, чтобы электродные процессы были очень быстрыми, это ограничивает число систем, которое можно использовать в качестве индикаторы электродов; *Зависимость потенциала электрода от конц. анализируемого ве-ва явл. логарифмической, поэтому небольшая ошибка при измерении

потенциала может привести к большой погрешности определения конц. С9

Кондуктометрические биосенсоры

Кондуктометрия-это хим. метод анализа, основанный на измерении электропроводности ра-ра. Поскольку ионы водорода и гидроксил-ионы обладают наиболее высокой подвижностью, то фактически кондуктометрические датчики реагируют на изменение рН среды. Т. о., измерение электропроводности выступает как альтернатива потенциометрическому анализу. В разбавл. ра-рах сигнал кондуктометрического сенсора более чувствителен к изменению конц., чем потенциал ионселективного электрода. Основным - кондуктометрических биосенсоров явл. зависимость сигнала от неспецифических изменений, сопровожд. биохимическую ре-цию.

Амперометрические биосенсоры

Амперометрия-частный случай постояннотоковой вольтамперометрии, основан. на измерении тока при постоянном фиксированной значении потенциала в области предельного тока. Известно 3 типа генерации сигнала в биосенсорах католического типа:

*Электрохим. регистрация убуля одного из субстратов или образование продукта ре-ции; *Медиаторный перенос электрона; *Прямой перенос электронов. С10

Кислородный электрод

На первых этапах развития биосенсорных исследований, кислородный электрод Кларка исп. как основной тип преобразователя в биосенсорах. С11

При включении питанием электрода напряжение поляризации подается на катод и анод. Период поляризации электродом всегда занимает относительно много времени. Оптимальным режимом исп. амперометрической системы явл. такой, при котором электрод находится во включенном состоянии, даже если измерение не производится. При потенциале поляризации -700 мВт, приложенном к катоду относительно А происходит следующие электрохим. ре-ции:

Катодная реакция: О₂+2Н₂О +4е^-  4ОН^-

Анодная реакция: 4Ag +4Cl^-  4AgCl + 4e^-

Указанные хим. ре-ции приводят к протеканию тока, кот. пропорционален парциальному давлению О₂. Кислород. электрод поглощает О₂, кот. поступ. к его поверхности из ра-ра. В этой связи важными параметрами явл. вязкость ра-ра и скорость потока у поверхности электрода.

I = . Для большинства кислородный электродов сила тока в ра-ре без перемешивание ниже силы тока в потоке жидкости. Потребление О₂ электродом

С9

С10

С11

приводит к обеднению поверхностного слоя на наружней стороне мембраны. В зону обеднения О2 из ра-ра поступает за счёт диффузии. Если ток электрода достаточно велик, то поступление О2 не обеспечивается диффузией. Это приводит к снижению тока по сравнению с тем, который должен был соответствовать в условии ра-р. В перемешивающих же ра-ре О2 поступает к поверхности за счет диффузии и в ре-те доставки с потоком жидкости. Т.О. обеднение поверхностного слоя не происходит.